三种致奶牛流产病原多重巢式PCR检测方法的建立与应用

发布时间：2017-12-07 15:05

  本文关键词：三种致奶牛流产病原多重巢式PCR检测方法的建立与应用

  更多相关文章： 奶牛 流产 多重巢式PCR 新孢子虫 布氏杆菌 弓形虫

【摘要】：近些年来,养殖奶牛流产率居高不下,某些地区奶牛的流产率甚至可以达到20%以上,给养殖户来带难以忽视的经济损失。因此,快速并准确的检测出引起奶牛流产的原因,对预防和控制奶牛流产具有相当重要的意义。通过随机调查走访后,发现周口地区各个奶牛养殖场(饲养小区)部分奶牛流产率高达21%。其中在第2-4胎的母牛流产率明显高于其他胎次,流产率可以达到16.95%~25.53%;母牛流产多发于春秋季,该时间段内流产数量占总流产数的48.76%(236/484)。新孢子虫、布氏杆菌和弓形虫是引起奶牛流产的三种常见病原,为同步检测引起奶牛流产的三种常见病原新孢子虫、布氏杆菌和弓形虫,本研究分别设计针对新孢子虫ITS1基因(Nc-ITS1)、布氏杆菌16S r RNA基因(Ba-16S rRNA)及弓形虫529 bp重复序列基因(Tg-529 bp)的特异性巢式PCR引物,建立并优化了能够同时检测这三种病原的多重巢式PCR方法。结果显示,多重巢式PCR对Nc-ITS1、Ba-16S r RNA及Tg-529 bp扩增产物的大小分别为601 bp、380bp、245 bp。外引物退火温度为57℃,内引物为53℃;Taq酶、d NTP和Mg2+浓度分别为1.0 U、2.0 mmol/L和1.0 mmol/L;Ba-16S rRNA、Nc-ITS1和Tg-529 bp外、内引物浓度均为0.4μmol/L。该多重巢式PCR对Nc-ITS1和Ba-16S rRNA检测敏感性达3×102拷贝/反应,对Tg-529 bp达3×101拷贝/反应,对住肉孢子虫、大肠杆菌、沙门氏菌、李氏杆菌、金黄色葡萄球菌和链球菌扩增均无目的条带,表明本研究构建优化的多重巢式PCR检测方法拥有良好的敏感性和特异性。同时使用该方法与单巢式PCR方法对30临床流产样本进行诊断,其诊断结果一致。表明该方法在临床样品检测中拥有较好的应用效果。应用该方法检测周口地区的172份临床样品,结果显示新孢子虫阳性52份,布氏杆菌阳性4份,弓形虫阳性2份,其中新孢子虫和布氏杆菌混合感染1份。结果表明,新孢子虫病是造成周口地区奶牛发生流产的主要原因之一,为进一步防控该地区奶牛流产提供一定参考。
【学位授予单位】：河南科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S858.23

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