细菌表达dsRNA和寄主表达hairpin dsRNA介导的玉米黏虫chitinase基因的RNA干扰研究

发布时间：2017-12-08 14:18

  本文关键词：细菌表达dsRNA和寄主表达hairpin dsRNA介导的玉米黏虫chitinase基因的RNA干扰研究

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【摘要】：玉米黏虫(Mythimna separata)属于鳞翅目夜蛾科,是一种重要的农业害虫,严重暴发时会造成农作物大面积减产甚至绝收。RNA干扰(RNA interference,RNAi)是指生物体内源或者外源的双链RNA(double-stranded RNA,dsRNA)介导产生特异性的转录后基因沉默的现象。RNAi除了在模式昆虫如果绳(D.melannogaster)中得到广泛应用以外,在非模式昆虫中也得到了成功的应用。进一步研究发现,RNA干扰技术与第二代测序技术相结合,可以快速找到非模式昆虫的致死效应的靶基因序列,加快了利用RNAi技术控制害虫的步伐。本研究以玉米黏虫几丁质酶编码基因(chitinase)为候选基因,分别设计合成了chitinase 和chitinase2基因RNA干扰序列,为了达到RNA干扰效应,我们设计了两个实验方案。第一,采用了细菌表达dsRNA的RNA干扰系统(即大肠杆菌HT115和L4440载体)对靶基因进行了 RNA干扰。根据L4440载体的两端各有一个T7启动子的特点,设计并构建了针对玉米黏虫几丁质酶(chitinase)基因的RNA干扰载体,将构建成功的重组载体导入大肠杆菌HT115感受态细胞中。在IPTG诱导下,成功获得了靶标基因(chitinael和chitinae2)所对应的dsRNA。诱导产生的dsRNA经纯化后,混合人工饲料饲喂玉米黏虫幼虫。持续饲喂七天后,进行实时荧光定量PCR鉴定玉米黏虫编码几丁质酶(chitinase)基因的mRNA表达量。结果表明,chitinase1和chitinase2基因的表达量相比于对照组均有明显降低的现象,显示目的基因的表达受到了特异性的抑制。同时发现,对chitinase1、chitinase2基因的特异的干扰也引起了玉米黏虫的体重减少和死亡率增加的现象。第二,将上述chitinase1和chitinase2基因片段以hairpin dsRNA的形式在植物中表达,深入研究利用RNA干扰技术培养抗玉米黏虫的转基因农作物。利用Gateway克隆技术构建了含有目的基因的hairpin dsRNA植物双元表达载体。将构建成功的植物双元表达载体导入水稻中,获得稳定表达靶基因的转基因水稻。结果表明,入门载体和植物双元表达载体均构建成功并且获得了稳定表达靶基因的转基因水稻。经卡纳霉素抗生素筛选和PCR鉴定,分别得到了转chi1基因的22株和chi2基因的13株植物。
【学位授予单位】：内蒙古大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S433.4

【参考文献】

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1 张丽萍;;黏虫的生活习性及防治措施[J];农业技术与装备;2013年16期

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本文编号：1266688