中蜂幼虫酵母双杂交文库构建及其与囊状幼虫病毒VP3互作蛋白筛选

发布时间：2017-12-10 17:07

  本文关键词：中蜂幼虫酵母双杂交文库构建及其与囊状幼虫病毒VP3互作蛋白筛选

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【摘要】：目的通过构建中华蜜蜂幼虫酵母cDNA文库,利用酵母双杂交系统筛选与中蜂囊状幼虫病毒(Chinese sacbrood bee virus,CSBV)VP3相互作用的宿主蛋白,并对其相互作用进行鉴定,为深入研究CSBV的致病机理奠定基础。方法提取中华蜜蜂幼虫总RNA,合成cDNA与p GADT7连接,构建中华蜜蜂幼虫酵母cDNA文库,并对文库的的滴度、插入片段的大小进行检测。在此基础上,将CSBV VP3基因克隆至真核表达载体pGBKT7,构建诱饵质粒pGBKT7-VP3,将诱饵质粒pGBKT7-VP3转入酵母感受态细胞中,检测其自激活能力及对酵母细胞的毒性作用。将含有诱饵质粒pGBKT7-VP3的酵母感受态细胞与中华蜜蜂幼虫的cDNA文库进行融合,利用酵母双杂交系统筛选出阳性克隆,挑取阳性克隆作为PCR的模板,进行PCR扩增,送测序,参照相关的文献对捕获蛋白测序结果进行分析,推测与VP3可能的互作蛋白,半乳凝素1(Galectin1),将获得的Galectin1基因克隆到p GADT7载体上,进行酵母回返实验。同时,根据大肠杆菌密码子偏嗜性分别对Galectin1基因和VP3基因进行密码子优化,构建p GEX6P-1-Galectin1和p ET28-a-vp3重组原核表达质粒,进行原核表达纯化,利用Far-western blot技术验证Galectin1与VP3的相互作用。结果本研究提取到了高纯度未降解的RNA,能够达到构建中华蜜蜂幼虫酵母cDNA文库的要求,所构建的中华蜜蜂幼虫酵母cDNA文库容量为1.25×107 cfu,文库滴度为2.5×106 cfu/m L,对随机挑选24个阳性克隆进行PCR扩增,电泳检测结果显示插入片段均匀分布,大小在1.5-3 kbp,24个阳性克隆PCR产物电泳泳道中无空白,由此可知文库的重组率为100%。将构建的诱饵质粒pGBKT7-VP3转入酵母感受态细胞,表明诱饵质粒pGBKT7-VP3无自激活能力且对酵母细胞无毒性。在此基础上,从中华蜜蜂幼虫的cDNA文库筛选出了与CSBV VP3蛋白相互作用的宿主蛋白:Galectin1,通过对Galectin1基因和VP3基因密码子优化,实现重组蛋白p GEX6P-1-Galectin和p ET-28a-VP3在大肠杆菌中高效表达,并对重组蛋白分别进行纯化。通过酵母回返实验初步验证和Far-western blot技术证实,Galectin1与VP3存在相互作用。结论1、成功构建了中华蜜蜂幼虫酵母cDNA文库。2、成功构建了pGBKT7-VP3诱饵质粒,并利用酵母双杂交系统筛选出了与VP3相互作用的蛋白,Galectin1。3、经酵母回返实验和Far-western blot技术的验证,Galectin1与VP3确实存在相互作用。
【学位授予单位】：锦州医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S895

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本文编号：1275224