抗中蜂囊状幼虫病毒VP2蛋白卵黄抗体制备及其间接ELISA检测方法的建立

发布时间：2017-12-11 20:19

  本文关键词：抗中蜂囊状幼虫病毒VP2蛋白卵黄抗体制备及其间接ELISA检测方法的建立

  更多相关文章： 中蜂囊状幼虫病毒 VP2基因 密码子优化 原核表达 免疫原性研究 酶联免疫吸附试验

【摘要】：目的利用生物信息学软件对编码中蜂囊状幼虫病毒(Chinese sacbrood virus,CSBV)结构蛋白VP2的密码子进行优化和原核表达,并用其制备卵黄抗体。同时利用纯化VP2蛋白作为包被抗原建立检测抗CSBV卵黄抗体的间接ELISA方法。方法通过对17株囊状幼虫病毒(SBV)和7株中蜂囊状幼虫病毒(CSBV)的VP2基因序列进行比对,选取代表毒株(Gen Bank:HM237361.1)CSBV-LN株VP2基因作为参考序列,并用在CSBV所有毒株中保守性相对较强的氨基酸替换CSBV-LN株VP2对应位置的氨基酸,通过在线软件(http://www.jcat.de/和http://genomes.urv.es/OPTIMIZER/)对其密码子进行优化,构建原核表达质粒p ET-28a-opti VP2,并转化入BL21(DE3)中,进行诱导表达。表达产物经SDS-PAGE和Westren blot鉴定正确后,将纯化的表达蛋白免疫白来杭母鸡,检测免疫鸡的抗体水平和淋巴细胞增值指数进行,分析CSBV VP2蛋白的免疫原性,同时收集免疫后鸡蛋制备卵黄抗体,经纯化卵黄抗体与CSBV相互作用1 h后,接种于2-3日龄中华蜜蜂幼虫,观察幼虫死亡率,研究卵黄抗体中和CSBV病毒能力。为了对制备的抗CSBV VP2卵黄抗体进行检测,本研究以纯化的VP2蛋白作为包被抗原,并通过对包被抗原浓度、卵黄抗体稀释度、酶标二抗稀释倍数、阴阳性临界值的确定以及敏感性试验、重复性试验,建立检测抗CSBV卵黄抗体的间接ELISA检测方法。结果17株SBV分离株遗传进化分析表明,SBV形成两个分支,其中感染西方蜜蜂(Apis mellifera L)的SBV形成一个分支,而包括7株CSBV在内的感染东方蜜蜂(Apis cerana F')的SBV形成另一个分支。7株CSBV的VP2氨基酸序列比对分析表明,不同毒株间氨基酸同源性介于94%-99.6%,其中CSBV-LN株(Gen Bank:HM237361)与各株间同源性相对较高(94.4%-99.6%),因此选择CSBV-LN株的VP2基因序列为参考序列,同时用在CSBV所有毒株中保守性相对较强的氨基酸替换CSBV-LN株VP2对应位置的氨基酸,将CSBV-LN株VP2上的第49、84和148位上的天冬酰胺(N)、组氨酸(H)和缬氨酸(V)分别替换为丝氨酸(S)、苏氨酸(T)和异亮氨酸(I),进行密码子优化和原核表达。优化后的opti VP2能够在大肠杆菌中高效表达,其表达产物接种白来杭母鸡可诱导其产生特异性抗CSBV抗体,且抗体水平明显高于PBS组(P0.05);脾淋巴细胞增值指数的测定结果显示VP2蛋白免疫组与纯化病毒免疫组的SI值差异不显著(P0.05),但与PBS组差异显著(P0.05);中和试验结果显示,病毒接种量在小于等于1x107拷贝/只时制备的抗CSBV VP2卵黄抗体组和非免疫鸡蛋提取的卵黄抗体组幼虫死亡率差异显著(P0.05),而与PBS组差异不显著(P0.05)。同时确定ELISA方法抗原最适包被浓度为800 ng/孔,卵黄抗体的最佳稀释度为1:100,酶标二抗最佳稀释倍数为1:1000。在此基础上,确定该ELISA方法阴阳性临界值判定标准为1.2661,并表现出良好的敏感性和重复性。结论1、通过对密码子的优化实现了CSBV结构蛋白VP2在原核系统的高效表达。2、鸡免疫实验表明VP2蛋白具有良好免疫原性,而且用其制备的卵黄抗体,具有中和CSBV能力,为进一步开发防治CSBV的生物制剂奠定了基础。3、利用纯化CSBV VP2蛋白作为包被抗原建立了抗CSBV卵黄抗体间接ELISA检测方法。
【学位授予单位】：锦州医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S895

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