猪瘟病毒E2蛋白单克隆抗体的制备及其表位鉴定分析

发布时间：2017-12-12 08:02

  本文关键词：猪瘟病毒E2蛋白单克隆抗体的制备及其表位鉴定分析

  更多相关文章： CSFVE2蛋白 单克隆抗体 抗原表位

【摘要】：猪瘟(classical swine fever,CSF)是由猪瘟病毒(classical swine fever virus,CSFV)引起的一种高度接触性、致死性传染病。在CSFV编码的结构蛋白中,E2囊膜蛋白作为CSFV主要免疫原性蛋白,能够诱导机体产生中和抗体,是新型疫苗的主要研究对象,也是建立CSFV血清学检测方法的首选抗原。以CSFV E2蛋白作为免疫原制备的单克隆抗体具有病毒中和能力,在CSFV的生物学特性、抗原性及表位研究、免疫学诊断、流行病学研究等方面具有重要的应用价值。已有研究证明E2蛋白上存在多个抗原表位,包括线性表位和构象表位。为进一步对E2蛋白表位进行定位和分析,本研究采用杆状病毒表达猪瘟病毒C株E2蛋白作为免疫原蛋白,免疫BABL/c小鼠,通过细胞融合、筛选及亚克隆,获得4株抗CSFV E2蛋白单抗,分别命名为E2-1,E2-2,E2-3,E2-4。经测定4株单抗均属于IgG1亚型,轻链为κ链。制备腹水并纯化单抗,鉴定结果显示4株单抗抗体效价分别为1:102400、1:102400、1:204800、1:102400,而且均能与猪瘟C株发生反应,与BVDV无交叉反应,均能中和CSFV Thiveral株,其中单抗E2-3与Thiveral株的中和效价高达1.6×105倍。为进一步鉴定单抗识别的抗原表位,从所筛选的4株单克隆抗体中,选择病毒中和活性和效价最高的单抗E2-3进行表位鉴定。本实验采用PEPperMAP?表位图谱技术,按照猪瘟病毒C株E2全长(除跨膜区),用多肽重置的方法人工合成314条长度为15个氨基酸的多肽,制备多肽芯片,用单抗E2-3进行反应,发现存在一条9个氨基酸的特异性多肽序列(正在申请国家专利)与单抗E2-3特异性结合,且与国际上著名的单抗WH303表位(TAVSPTTLR)不在同一位点。为进一步确定该表位的关键氨基酸位点,本研究对筛选出来的特异多肽序列,采用氨基酸替换实验,将表位中氨基酸逐一替换,制备多肽芯片,与单抗E2-3反应分析。结果显示单抗E2-3与酸性氨基酸(D、E)和芳香族氨基酸(W、Y)亲和能力较强,而抗原表位中存在3个天冬氨酸(D)与之对应。因此推测该表位中的3个D可能为关键的结合位点。为了验证表位中的3个D是否为关键的结合位点,本实验在多肽水平表位鉴定的基础上进一步了研究3个D的作用机制。利用杆状病毒表达系统进行关键氨基酸突变表达试验,在杆状病毒CSFV E2蛋白转移载体上对3个D分别进行单一突变、双突变、三突变,对表达产物进行反应鉴定。结果显示单抗E2-3与突变后表达产物结合能力并未出现明显的下降,推测这3个D位点可能并不是关键氨基酸位点,而是由多个氨基酸位点共同决定,其作用机制还需进一步研究。为了确定单抗E2-3与不同基因亚型CSFV广谱性,实验中复壮分离了22株CSFV流行毒株,并对其进行E2基因主要编码区序列分析。发现22株流行毒株分属1.1、2.1和2.2三个基因亚型,并以2.1基因亚型毒株为主。而对22株CSFV流行毒株与单抗E2-3进行反应性分析后发现,单抗E2-3与三个基因亚型毒株均发生反应,证明单抗E2-3具有广谱性,但只与9株2.1亚型毒株不发生反应,说明不同流行毒株之间存在一定抗原谱差异。综上所述,本研究制备了4株特异性抗CSFV E2蛋白单克隆抗体,均具有病毒中和活性。对其中的一株抗体效价最高的单抗E2-3进行抗原表位鉴定,确定了一个不同于国际上著名的单抗WH303的线性表位(正在申请专利);采用氨基酸替换和突变研究,发现鉴定表位中的3个D并不是关键位点,推测可能是由多个氨基酸共同影响单抗E2-3的结合能力;同时,通过该单抗E2-3与不同流行毒株反应性分析,证明CSFV流行毒株具有不同的抗原谱。
【学位授予单位】：中国兽医药品监察所
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S852.65

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 赵雨杰;钟连声;何群;梁彬;王绍成;潘忠诚;王天骄;;生物芯片在微生物学研究中的应用[J];微生物学杂志;2016年01期

2 范学政;徐璐;赵启祖;宁宜宝;邹兴启;朱元源;丁家波;王琴;;猪瘟兔化弱毒E2基因重组杆状病毒的构建及抗体制备[J];中国兽药杂志;2015年01期

3 彭志成;龚文杰;吕宗吉;胡敬东;郭焕成;涂长春;;广东省猪瘟病毒流行毒株遗传多样性分析[J];中国兽医学报;2014年06期

4 王琴;赵耘;范学政;徐璐;张正兴;陈锴;宁宜宝;丘惠深;王在时;;国内部分猪瘟病毒流行株抗原性分析[J];中国预防兽医学报;2012年06期

5 陈景艳;尹晓磊;王宜;袁丽;王超;邓宏魁;钱永华;袁克湖;;应用假病毒和假型病毒制备抗猪瘟病毒E2蛋白中和性单克隆抗体的初步研究[J];中国预防兽医学报;2010年04期

6 徐和敏;王琴;徐璐;范学政;;猪瘟病毒E2基因噬菌体展示多肽库的构建及表位鉴定[J];畜牧兽医学报;2010年01期

7 侯强;彭伍平;孙元;仇华吉;;猪瘟病毒E2蛋白主要抗原区编码基因的原核表达及其单克隆抗体的制备[J];中国兽医科学;2008年01期

8 张长弓;黄印尧;郑海明;方莹;孔繁德;沈浩龙;何琼;黄雅萍;文芳;;猪瘟病毒抗原胶体金快速检测试纸的研究[J];福建畜牧兽医;2007年06期

9 王钰璇;姚凤;伏小平;王若聪;周清燕;刘坤;祝丽;王玉东;龚振华;;猪瘟病毒E0蛋白的表达与抗原性研究[J];中国动物检疫;2007年08期

10 刘建文;余兴龙;张丽颖;涂长春;;单克隆抗体捕捉猪瘟病毒抗原ELISA方法的建立[J];畜牧兽医学报;2006年05期

中国硕士学位论文全文数据库 前6条

1 王万利;应用噬菌体展示技术筛选抗猪瘟病毒E2蛋白单克隆抗体的模拟表位[D];中国农业科学院;2009年

2 刘俊;MGB荧光定量PCR鉴别检测猪瘟病毒及其动态分布规律研究[D];西南大学;2009年

3 夏照和;特异性识别猪瘟病毒野毒株的单克隆抗体的制备[D];中国农业科学院;2008年

4 彭伍平;利用噬菌体展示技术鉴定猪瘟病毒E2蛋白抗原表位[D];中国农业科学院;2007年

5 徐和敏;猪瘟病毒E2基因噬菌体展示多肽库的构建及表位研究[D];中国兽医药品监察所;2007年

6 马钢;猪瘟病毒E2蛋白单抗的制备、纯化及其抗原表位的初步研究[D];中国人民解放军军需大学;2001年

，

本文编号：1281734