绵羊肺腺瘤病PCR检测技术的建立及exJSRV与enJSRV载量相关性分析

发布时间：2017-12-13 19:08

  本文关键词：绵羊肺腺瘤病PCR检测技术的建立及exJSRV与enJSRV载量相关性分析

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【摘要】：绵羊肺腺瘤病(OPA)的病原是绵羊肺腺瘤病毒(JSRV),是一种可传播的绵羊肺肿瘤疾病。OPA自19世纪被发现以来,至今也没可靠的方法控制其传播,并且影响着很多国家养羊业的发展。该病有一个重要特点就是在OPA病羊血液中未曾检测到循环抗体,所以不能用常规的血清学方法进行诊断。为了建立针对该病灵敏度高、特异性好的检测方法,以及探究外源性绵羊肺腺瘤病毒(exJSRV)和内源性绵羊肺腺瘤病毒(enJSRV)的相对表达量是否存在相关性,本研究建立了巢式RT-PCR和exJSRV Taqman实时荧光定量PCR检测方法,针对OPA的早期、快速检测。根据GenBank上发表的exJSRV基因序列(登录号JQ837489.1与AF105220.1)设计合成巢式RT-PCR、Taqman实时荧光定量PCR引物及扩增exJSRV-env全基因的引物。利用双标准曲线的方法对检测样品进行分析,比对各样品中exJSRV与enJSRV的载量关系。对两种方法检测出的阳性血样的羊只进行跟踪试验,进行组织病理学验证。巢式RT-PCR、Taqman实时荧光定量PCR方法分别可检测到9.72 fg的病毒RNA和为10-1 copies的标准质粒。特异性试验结果表明两种方法仅可特异性的扩增exJSRV。临床检测阳性的部分样品(1份鼻液和2份血样)经送检测序,序列比对结果显示鼻液、血样的巢式外套与内套RT-PCR扩增产物与JQ837489.1同源性均高达98.9%以上,且扩增基因序列翻译的氨基酸序列中具有外源性绵羊肺腺瘤病毒特有的致病性"YXXM"序列。所建立的qPCR的标准曲线循环数与模板浓度呈良好的线性关系。同时分析比较同一样品中exJSRV与enJSRV相对表达量的关系发现在自然感染病肺中、本实验室长期跟踪羊只的肺组织及疑似OPA羊只的鼻液中,exJSRV都较enJSRV有高表达量,而血样中正好相反,这正好解释了对各样品进行exJSRV-env全基因的扩增,病肺与鼻液的扩增产物与exJSRV具有高同源性;血样的扩增产物与enJSRV同源性高。本试验所建立的方法,具有良好的临床应用价值且灵敏性高、特异性好,这对OPA的早期检测提供了一种方便、可靠、经济实用的诊断方法,并且为定量分析exJSRV感染程度奠定了基础。
【学位授予单位】：内蒙古农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S858.26

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本文编号：1286239