GhCOI1和GhMYC2基因对棉花黄萎病抗性的VIGS分析

发布时间：2017-12-13 19:25

  本文关键词：GhCOI1和GhMYC2基因对棉花黄萎病抗性的VIGS分析

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【摘要】：为了对抗生物或非生物逆境胁迫,植物在漫长的进化中获得了相应的生理机能来行使应答或防御功能。作为一类非常重要的自身代谢物,植物激素在其生长发育过程中的作用是其它种类化合物无法直接替代的。茉莉酸(Jasmonate acid,JA)及其衍生物质能直接诱导并调节植物防御反应,调控许多相关的转录因子的来行使各种生理功能。人们对于茉莉素类信号转导过程已有了初步了解,发现了许多调控效应基因和关键应答调节转录因子,目前为止对其都已经有了较多报道与研究,但是在农作物,尤其在棉花等经济作物中的研究尚需进一步深入。植物中冠菌素不敏感因子(Coronatine-insensitive 1,COI1)是茉莉酸(Jasmonate,JA)信号转导途径的关键调控因子。在拟南芥中,COI1缺失突变体表现为对各种茉莉酸应答反应不敏感或者不响应,在受到病原菌侵染时不能及时反馈信号分子,无法使得相应应答反应基因表达。研究表明,植物中髓细胞组织增生蛋白(Myelocytomatosis proteins,MYCs)是茉莉酸类激素响应途径中的核心转录因子,并广泛的存在于动植物中。MYC2转录因子属于植物螺旋-环-螺旋转录因子家族(basic helix-loop-helix protein,bHLH),它对JA信号的传递起着非常重要的作用。病毒诱导基因沉默(Virus-induced gene silencing,VIGS)是指病毒载体侵染植物后,能够诱导当代植物发生内源性基因沉默而出现表型变化的一种研究基因功能的技术。我们通过生物信息学分析克隆出棉花中的COI1基因和MYC2相关基因,通过上述VIGS方法沉默陆地棉中GhCOI1和GhMYC2这两个基因,分析其对V991的抗病反应,确定它们在棉花中的抗病性,为棉花在抗病育种方面的研究提供实验数据分析,同时为深入理解植物响应逆境胁迫的分子机制做出初步研究。取得的研究结果如下:1.通过NCBI数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)分析,电子克隆棉花相关的COI1和MYC2基因全长序列。用DNAMAN软件设计引物,以棉花基因组cDNA为模版扩增出目的基因全长,经酶切和测序鉴定,克隆GhCOI1与GhMYC2两个基因。2.我们对GhCOI1与GhMYC2两个基因表达的组织特异性进行分析,结果显示两个基因均在根中优势表达。对试验棉花接种V991后,结果显示GhCOI1与GhMYC2基因表达受到大丽轮枝菌侵染的诱导;GhCOI1在接种病菌12h后表达量最高,GhMYC2在接种3h后表达最高,随着时间的增加这两个基因表达量有所下降,但总体来说呈现上升趋势。3.针对目标序列通过Primer5.0软件设计特异引物,扩增得到沉默靶基因序列后再将该序列插入到病毒载体pYL-156上。经酶切和测序鉴定后,得到重组载体pYL-156-GhCOI1和pYL-156-GhMYC2。利用电击法将上述重组载体转入根癌农杆菌GV3101中,得到VIGS工程菌。在未长出真叶的棉花幼苗子叶上接种制备好的VIGS工程菌,获得沉默植株。4.待参照基因PDS出现叶漂白表型(白斑或完全失绿)后,提取对照植株和目的基因沉默植株的总RNA,反转录cDNA第一链后进行RT-PCR和qPCR检测。结果表明,沉默植株目标基因的表达均被抑制,基因沉默效果在85%以上。5.对上述GhCOI1和GhMYC2沉默植株分别接种致病菌V991,结果指出这两个基因沉默植株对大丽轮枝菌的耐受性减弱,表型显示它们更容易感染病菌,而对照植株对大丽轮枝菌有明显的耐病性。这些结果阐明了两个目的基因直接参与了棉花对大丽轮枝菌的抗性反应,而且GhCOI1和GhMYC2正调控棉花的抗病性。
【学位授予单位】：甘肃农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S435.62

【参考文献】

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本文编号：1286315