基于RT-LAMP的口蹄疫病毒（FMDV）通用型快速检测方法构建

发布时间：2017-12-16 16:34

  本文关键词：基于RT-LAMP的口蹄疫病毒（FMDV）通用型快速检测方法构建

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【摘要】：口蹄疫(foot and mouth disease,FMD)是由口蹄疫病毒(foot and mouth disease virus,FMDV)引起的一种动物传染性疫病,主要侵染偶蹄类动物,以猪,牛,羊易感,偶见于人和其他动物。FMD致死率较高,幼年个体死亡率高达100%,感染后常不见症状而猝死,成年个体死亡率较低。目前,FMD对畜牧养殖业及人类健康构成巨大威胁,是世界动物卫生组织(Office International des Epizooties,OIE)法定报告的动物传染病之一。FMDV为RNA病毒,变异较快,给疫苗研制带来巨大困难。病原学检测,血清学检测,分子生物检测等是常见的传统检测方法,但技术要求高,检测周期长,在基层单位检测及现场快速检测中应用受限。逆转录环介导等温扩增技术(reverse transcription loop mediacted isothermal amplification,RT-LAMP)是一种新技术,该技术操作简单,反应快速,仅需一个水浴锅,在一个小时内就可以完成核酸的检测。据此原理,本研究探索并建立了FMDV通用型RT-LAMP快速检测方法。主要研究结果如下:1)引物设计:对O型,A型及亚洲Ⅰ型3种血清型FMDV全基因组序列进行比对,利用LAMP引物在线设计软件primer explorer V5,设计40套RT-LAMP引物,根据LAMP评分原则等方法筛选出3套特异性引物,初步建立了FMD通用型RT-LAMP检测方法。2)方法优化:为提高RT-LAMP检测效率,对反应体系进行优化,最终确立的25μL的RT-LAMP最佳反应体系为:外引物(F3/B3)各12 m M,内引物(FIP/BIP)各40 m M,环引物(LF/LB)各35 m M,镁离子的浓度8 m M,甜菜碱的浓度为0.24 M,d NTP的浓度1.8 m M,Bst DNA大片段聚合酶浓度6.4U/μL,AMV反转录酶的浓度为0.16 U/μL,10×Bst DNA大片段聚合酶Buffer添加量2.5μL,染料添加量1μL,模板添加量2μL并用无菌双蒸水补足体系。LAMP反应程序为:63℃,60 min;80℃,10 min。3)敏感性检测:利用中国农业科学院兰州兽医研究所(简称兰兽研)提供的7种FMD代表毒株作为RT-LAMP敏感性检测方法的模板,同时利用兰兽研的FMD荧光检测试剂盒作对比,本研究的ΔRn值高于兰兽研检测ΔRn值,RT-LAMP检测方法敏感性高于兰兽研FMD荧光检测试剂盒敏感性。并且本研究方法对于目前国内常见的O型FMDV毒株Mya-98和Pan Asia,及A型毒株Sea-97 G2的敏感性较好。4)灵敏度检测:本研究所建立的检测方法能够同时检测出三种血清型FMDV,对O型的检测灵敏度最高。分别以10倍梯度稀释的O型,A型及亚洲Ⅰ型3种血清型FMDV核酸作模板,进行灵敏度检测,其检测下限分别是10-6,10-4和10-2。通过与OIE RT-q PCR检测方法、兰兽研FMDV检测试剂盒和中国动物疫病预防控制中心(简称疫控中心)RT-PCR方法作对比,O型检测灵敏度高于OIE RT-q PCR检测方法3个数量级,高于兰兽研FMDV检测试剂盒2个数量级,与疫控中心RT-PCR法接近;A型检测灵敏度高于OIE RT-q PCR检测方法和疫控中心RT-PCR法2个数量级,与兰兽研FMDV检测试剂盒接近;亚洲Ⅰ型检测灵敏度稍低于其它检测方法。5)特异性检测:本方法特异性强,分别以O型,A型和亚洲Ⅰ型口蹄疫病毒核酸、猪瘟病毒(classical swine fever virus,CSFV)、猪圆环病毒(porci ne circovirus,PCV)、猪细小病毒(porcine parvovirus,PPV)、猪伪狂犬病毒(p orcine pseudorabies virus,PRV)、猪蓝耳病毒(porcine reproductive and respir atory syndrome virus,PRRSV)、副猪嗜血杆菌(haemophilus parasuis,Hps)、牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)核酸作本研究特异性检测的模板,O型,A型和亚洲Ⅰ型的FMDV的反应液显示为阳性天蓝色,非FMD病毒反应液为阴性淡紫色。本研究建立了一种FMDV通用型RT-LAMP快速检测方法。该方法的敏感性好,灵敏度高,特异性强,适合于目前国内多发的FMDV类型的检测。对于现场FMDV的快速检测具有重要意义。
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S852.65

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