猪伪狂犬病病毒gE蛋白的表达及间接ELISA的建立

发布时间：2017-12-16 17:21

  本文关键词：猪伪狂犬病病毒gE蛋白的表达及间接ELISA的建立

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【摘要】：伪狂犬病(Pseudorabies, PR)的病原为伪狂犬病病毒(Pseudorabies Virus, PRV),属于甲疱疹病毒亚科,能感染除短尾猿以外的大多数哺乳动物,对猫、牛、羊、马等有致死性。PR是猪群中重要的直接或间接接触性传染病,猪是PRV病毒的唯一自然中间宿主,携带此病毒的猪可终身排毒,使得PR快速暴发,并造成严重的经济损失。PRV基因组全长约150 kb, GC含量高达74%,可编码70种以上病毒蛋白。其中,糖蛋白E(gE)作为PRV的重要毒力而非必需糖蛋白,对PRV感染神经组织起着决定性的作用,将gE基因从病毒全基因组中敲除,可得到经过弱化的基因缺失疫苗。在我国,感染PRV的猪场主要表现为猪群gE抗体的阳性率显著升高,母猪产下弱仔、死胎,并且仔猪出现了神经症状及死亡等情况；暴发疫情的养猪场接种了PRV gE基因缺失疫苗后,在死亡的仔猪以及流产胎儿的身上仍能分离到PRV野毒株,且存在gE基因的变异。说明仅接种gE基因缺失疫苗,而不配合使用gE蛋白的抗体诊断技术是无法有效控制PR疾病的。gE在所有野毒株中都有表达,可作为区分疫苗株与野毒株感染的标记蛋白。因此,建立快速高效的gE-ELISA诊断方法是非常必要的。目前,临床上我国主要使用昂贵的进口gE-ELISA试剂盒,不利于大面积推广。为建立一种适合我国的敏感、特异的猪伪狂犬病毒野毒抗体血清学检测方法,本研究通过对河南南阳猪场分离的PRV野毒株HNNYV1进行主要抗原表位区gE基因的克隆,PCR扩增了长约318 bp的gE片段,将此gE片段克隆至pET28a(+)表达载体,转化BL21菌株,经37℃、220 rpm、0.5 mM IPTG诱导8h获得重组gE蛋白的最大量表达。因重组蛋白具有His标签,经亲和层析柱纯化后,获得了高纯度的gE蛋白。通过免疫印迹检测证明具有良好的抗原性和特异性。同时,以纯化蛋白为包被抗原,经间接ELISA反应条件的优化,建立了检测伪狂犬病毒野毒抗体的间接gE-ELISA方法。具体如下：以纯化的gE蛋白做包被抗原,包被量为0.5 μg/mL,4%明胶37℃封闭2 h,待检血清1：100稀释、37℃孵育1.5h,酶标抗体1：40000稀释、37℃孵育1h, TMB显色10 min,测OD450nm,大于0.463判为阳性,小于0.402判为阴性,介于两者之间判定为可疑,可重复实验判定。该方法与猪圆环病毒(PCV)、蓝耳病(PRRSV)、PRV gB基本无交叉反应,批内与批间重复性试验的变异系数较小,显示重复性良好。该方法与IDEXX gE-ELISA抗体检测试剂盒的符合率为91.67%。本研究建立的间接gE-ELISA检测方法为PRV野毒抗体检测以及野毒感染的快速诊断与流行病学调查提供了一种新的血清学检测方法。
【学位授予单位】：南阳师范学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S852.651

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