PEDV检测纳米PCR方法的建立及其分子流行病学调查

发布时间：2017-12-23 10:49

  本文关键词：PEDV检测纳米PCR方法的建立及其分子流行病学调查　出处：《黑龙江八一农垦大学》2017年硕士论文　论文类型：学位论文

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【摘要】：猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea,PED)是由猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)引起,病毒粒子呈圆形或椭圆形,属于冠状病毒科,表面有囊膜,囊膜上有放射状纤突,囊膜内为核衣壳蛋白与RNA形成的蜷曲缠绕状结构。PEDV能够引起各个年龄阶段的猪感染,猪是唯一的感染动物,临床症状与传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus,TGEV)引起的症状类似,主要包括腹泻、呕吐、厌食、脱水及体重减轻等,仔猪的临床症状较为严重,出现大量的死亡,死亡率最高可达100%,给养猪业带来巨大的经济损失。纳米PCR方法是一种新型的PCR方法,目前研究较少,虽然不能够对病毒进行定量分析,但相较于普通PCR具有灵敏度高,特异性好的特点,并且比荧光定量PCR成本低,对设备要求低。所以本实验建立区分PEDV及TGEV的高效纳米PCR方法,能够快速、敏感、早期的区分鉴定PEDV或TGEV的感染。根据已经报道的PEDV及TGEV的N基因的序列设计两对引物分别扩增全长N基因,连接至p MD18-T载体上作为标准质粒。设计合成特异性的引物,以重组质粒为模板,对退火温度和引物加入量进行条件优化。灵敏性实验表明建立的纳米PCR方法比普通PCR方法敏感10倍,质粒PEDV-N、TGEV-N模板的最低检出量分别为7.6×101copies/μL、8.5×101copies/μL,病毒RNA的最低检出量为2.4×10-3μg/m L和1.7×10-2μg/m L;特异性结果表明不存在交叉反应。利用建立的纳米PCR方法对来自全国8个省份的121份临床样品进行检测,结果发现PEDV的阳性感染率较高达到45.45%,TGEV感染较少。与普通PCR相比较,纳米PCR能检出的病毒载量更低。设计引物分别扩增PEDV的S和ORF3基因,并进行序列分析和系统发育树分析;S基因的长度不同,且存在氨基酸的插入与缺失,点突变较多,系统发育树分析发现,所得到的毒株均与当前流行的毒株类似为变异株。ORF3基因长度不变,氨基酸上存在多个共有的突变位点,系统发育树分析发现,所得到的毒株分属于不同的进化关系。利用纳米PCR的敏感性的特点,建立鉴定PEDV的高效纳米PCR方法并用于临床诊断和流行病学调查,为PEDV的早期诊断提供新的方法;通过对PEDV的S及ORF3基因的动态检测,有利于对不同地区的PEDV的流行情况的了解,为疫苗的研发和疾病的预防提供有效的信息。
【学位授予单位】：黑龙江八一农垦大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S858.28

【参考文献】

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本文编号：1323600