舞毒蛾Ⅰ型几丁质酶β-4基序中关键氨基酸的活性研究

发布时间：2017-12-29 13:09

  本文关键词：舞毒蛾Ⅰ型几丁质酶β-4基序中关键氨基酸的活性研究　出处：《太原理工大学》2017年硕士论文　论文类型：学位论文

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【摘要】：舞毒蛾是世界性害虫,可寄生于500多种植物中,会对农林业造成巨大的威胁。为了控制舞毒蛾的危害,人们尝试了很多方法,其中生物防治法越来越受到关注。在舞毒蛾的表皮及中肠围食膜中存在大量的几丁质,几丁质是昆虫表皮及中肠围食膜的重要组成成分,也是昆虫防止生物危害和机械损伤的屏障。在昆虫的生长和发育过程中,表皮和围食膜必须定期降解与更新,其中几丁质的生物合成和降解对昆虫的生长发育起着至关重要的作用。昆虫几丁质酶是参与几丁质降解的关键性酶,其中,GroupⅠ几丁质酶因其在蛹到成虫变态发育过程中起到不可替代的作用,被认为是潜在的绿色农药设计靶标。舞毒蛾几丁质酶催化区的β-4基序FDG(L/F)DLDWE(Y/F)P中一些氨基酸参与了几丁质降解的催化过程,为了深入了解几丁质酶的催化机制及氨基酸之间的相互影响,首先对舞毒蛾几丁质酶中的天冬氨酸(D143,D145)及色氨酸(W146)进行了单点及多点突变,共获得了7种突变基因(D143E,D145E,W146G,D143E/D145E,D143E/W146G,D145E/W146G,D143E/D145E/W146G)。其次将突变基因和野生基因分别构建于pFastBacTM载体中,得到表达重组体,再将重组体导入DH10B大肠杆菌中,获得重组杆粒。最后利用转染试剂cellfectin reagent将其转染于Sf9细胞中,扩增病毒,用P3代病毒感染悬浮培养的Sf9细胞,得到了分子量约为70 kDa的高表达量的野生酶及7种突变酶。以4MU-(GlcNAc)3为底物对野生型及突变型几丁质酶的酶学性质及动力学参数进行进行研究,实验发现:1.在7种突变酶中,D145E,D143E/D145E和D145E/W146G具有催化活性,而突变酶D143E,W146G,D143E/W146G及D143E/D145E/W146G则完全丧失酶学活性。2.舞毒蛾野生型与突变型几丁质酶的最适pH及pH稳定性均为6.0,最适温度为50oC,在30-40oC稳定性较好。但与野生酶相比,突变酶最适p H及最适温度的活性范围均明显拓宽,且一些酶的热稳定性有所提高,说明突变酶具有更好的生产应用范围及经济价值。3.与突变酶相比,野生酶具有最高的kcat/Km值,但突变酶却比野生酶具有更小的Km值,说明突变后舞毒蛾几丁质酶对底物的选择性有所降低,但亲和力变强了。通过对舞毒蛾几丁质酶的定点突变,可以更系统的了解催化区重要氨基酸的作用以及它们间的相互影响,为绿色农药设计靶标提供理论支持。同时,几丁质的水解产物N-乙酰葡萄糖胺在医疗,食品及化工中均有广泛的应用,在酶解法水解几丁质生产N-乙酰葡萄糖胺中,突变酶与野生酶相比,具有更好的应用范围及经济价值。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：太原理工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：TQ453

【参考文献】

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本文编号：1350390