苹果抗病相关基因CERK1克隆与功能分析
本文关键词:苹果抗病相关基因CERK1克隆与功能分析 出处:《沈阳农业大学》2017年硕士论文 论文类型:学位论文
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【摘要】:苹果是我国栽培面积较大的果树之一,产量位于我国水果生产的首位,但苹果病害的发生制约着我国果树产业的发展。'寒富'苹果是沈阳农业大学育成优质的二倍体苹果品种,但在生产过程中受真菌危害造成严重损失。课题组前期通过秋水仙素处理得到其同源四倍体植株,生根移栽后发现,同源四倍体较二倍体植株对苹果病害的抗性增强,同时观察定植在沈阳农业大学教学科研基地的'嘎啦'苹果,其同源四倍体同样表现出较强的抗病性。多倍体育种是果树的抗病育种途径之一,多倍体果树生长旺盛,适应性强,抗逆性增加,目前研究广泛的苹果品种多为三倍体,四倍体较少,且主要集中于多倍体的生物学特性,果实性状,耐寒性等。从果实抗病育种的需求出发,开展同源四倍体苹果抗病性的研究有着重要的意义。本研究首先对'寒富'和'嘎啦'苹果及其同源四倍体叶片接种了炭疽病菌(Colletotrichum gloeosporioides),用以评价苹果二倍体与其同源多倍体抗病性差异。结合前期生物信息学分析结果和实时荧光定量PCR技术,发现了与四倍体抗病性增加有关的CERK1基因表达量升高。利用PCR方法首次从'寒富'苹果中分离得到了苹果CERK1基因的cDNA全长序列,成功构建了由35S启动子驱动CERKl基因的过表达载体,利用农杆菌介导法将过表达载体pOX-CERK1转入苹果和拟南芥中。最后对转基因植株进行人工接种,明确了CERK 基因功能与植株抗病性关系。本文评价了苹果二倍体及其同源四倍体抗病性差异,并且针对苹果抗病相关基因CERK1功能进行了研究,对苹果同源多倍化后植株抗病的分子机理和苹果抗病育种研究具有重要意义,主要研究结果如下。1.采用人工接种的方法对'寒富'和'嘎啦'苹果及其同源四倍体进行抗病性比较。观察'寒富'和'嘎啦'苹果及其同源四倍体叶片侵染炭疽病菌后发病情况,调查发病率和病情指数。结果表明,'寒富'和'嘎啦'苹果有相似表现,四倍体叶片发病程度较二倍体叶片轻,病情指数和发病率较低,结合分子生物学方法,运用实时荧光定量PCR技术对防御相关基因的表达进行分析,证明同源四倍体苹果较其二倍体具有更优良的抗病性能。2.通过'寒富'苹果同源四倍体转录组数据和实时荧光定量技术(qRT-PCR)确定受炭疽病菌诱导的抗病相关基因,克隆获得了CERK1基因全长序列,cDNA全长1983bp。以pRI-101 AN为载体,将CERK1融合到pRI-101 AN上,构建成苹果CERK1基因过表达载体,命名为pOX-CERK1。3.利用农杆菌介导法,将pOX-CERK1载体导入苹果'GL-3'和拟南芥中。目前'GL-3'苹果得到4个pOX-CERK1转化株系。通过再生试验,目的基因和NPTⅡ基因检测说明苹果CERK1基因已经整合到'GL-3'苹果中并得到超量表达。随机挑选4个转化获得的拟南芥株系进行目的基因和NPTⅡ基因检测,结果证明4个拟南芥株系均为pOX-CERK1转化植株。4.采用农杆菌介导法进行苹果CERK1基因同源表达和异源表达,人工接种方法验证其功能。以同源表达苹果CEPK1基因的苹果'GL-3'组织培养苗叶片和异源表达苹果CERK1基因的T2代拟南芥植株为试材,进行抗病性分析,人工接种后,苹果和拟南芥转化植株与对照相比发病程度降低,说明苹果CERK1基因的过表达能够增加植株抗病性。采用实时荧光定量PCR技术,发现病原菌侵染后叶片中防御相关基因PR1、CDPK的表达量明显升高,与前期结果相吻合,苹果CERK1基因是抗病相关基因,苹果同源加倍后抗性增强与其上调表达相关。
[Abstract]:......
【学位授予单位】:沈阳农业大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:S436.611
【参考文献】
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,本文编号:1350653
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