番茄生长素酰胺水解酶ILR在花柄脱落过程中作用研究

发布时间：2017-12-30 04:04

本文关键词：番茄生长素酰胺水解酶ILR在花柄脱落过程中作用研究　出处：《沈阳农业大学》2017年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：生长素在调控器官脱落的过程中发挥着重要的作用。结合态生长素可被生长素酰胺水解酶(IAA-Leucine Resistant 1-like Hydrolase,ILR)催化,然后释放出游离态的生长素(IAA)。关于生长素对番茄花柄脱落的调控机理已有一定的研究基础,但是关于生长素酰胺水解酶对其调控作用还不清楚。本研究分析了番茄ILR蛋白结构和水解酶活性,结合态生长素以及CHX对番茄花柄脱落过程的影响,结合ILJR基因的时空表达,并利用VIGS手段抑制ILR表达,研究其对花柄脱落的影响。主要研究结果如下:1.利用不同浓度的IAA-Ala,IAA-Ile和IAA-Asp处理番茄花柄外植体,其中IAA-A1a,IAA-Ile可以显著延缓脱落发生,IAA-Asp不能调控脱落,证实ILR参与了番茄花柄脱落过程。在不同时间加入IAA-Ile和不同的时间移除IAA-Ile培养基,证实脱落前8小时处理均可以延缓脱落发生。进一步利用番茄生长素响应标记植株DR5并结合生长素含量的测定,检验IAA-Ile处理后离区生长素的动态变化,结果表明:外源的IAA-Ile可以有效的提高离区生长素含量。采用蛋白合成抑制剂CHX处理证实,单一添加足量生长素螯合物不能起到延缓脱落的作用。2.采用保守序列Blast的策略,通过已知物种拟南芥,水稻,大白菜的蛋白比对,找到保守序列后搜索NCBI和SOL,获得了 7个(ILR1,ILR,ILR 3,IR4,ILR 5,ILR 6,ILR 7即ILR-7)番茄ILR基因。对七个ILR进行聚类进一步分析发现都具有M20活性中心和M20结合位点。将已知蛋白的序列进行聚类分析,发现ILR有着较大的不同,暗示,家族蛋白可能存在特异的功能。通过体外诱导蛋白合成并检测其活性,证实所有的ILR蛋白均具有活性。对纯化的蛋白进行HPLC分析,发现ILR 1-7对IAA-Ala和IAA-Ile都有水解活性,对IAA-Ala的水解力要高于IAA-Ile。3.利用qRT-PCR技术分析ILR组织特异性发现,SlILR 1,5,6和7在离区有较高的表达水平,暗示这五个基因也许在离区发育和脱落过程中发挥关键作用。利用生长素和乙烯相对应加速和延缓脱落过程,分别用IAA和1-MCP处理番茄外植体,调查这一过程中ILR的时空表达差异,结果显示SlILR 1,5,6表现出脱落特异的表达模式。4.采用VIGS病毒沉默策略,农杆菌菌液侵染番茄叶片。分别进行单独的SlILR13,5,6,7沉默,并进行了双重以及多重SlILR1+5,SlILR 1+6,SlILR 5+6以及SlILLR 1+5+6沉默。利用qRT-PCR检测鉴定阳性植株,对鉴定出的阳性转基因植株进行花柄脱落率的测定。测定结果显示,ILR转基因植株的脱落率高于对照,并且发现SlILR 1,.5,6以及1+5,1+6,1+5+6的转基因植株花柄脱落率显著高出对照。结果说明ILR基因参加并可延缓番茄花柄脱落的过程,其中SlILR1,5,6是调控脱落的关键基因。综上所述,番茄中共得到7个ILR家族成员,分别是ILR1,ILR2,ILR3,ILR 4,ILR5,ILR6,IR7。对ILR 1-7聚类分析,发现他们都具有M20活性中心和M20结合位点。对ILR蛋白序列进行聚类分析,发现ILR之间存在着较大的差异,并且这7个蛋白都具有活性,暗示家族蛋白可能存在特异的功能。通过实验证实,ILR参与了番茄花柄脱落的过程,并且在番茄花柄脱落过程中,存在着生长素螯合物以及生长素酰胺水解酶不足的情况,最终结果发现ILR 1,5,6是调控脱落的关键基因。
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【学位授予单位】：沈阳农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S641.2

【参考文献】