黄曲霉毒素B1诱导巨噬细胞自噬及胞外陷阱产生的机制研究

发布时间：2018-01-19 14:12

本文关键词： 黄曲霉毒素B1 巨噬细胞自噬 ROS 胞外陷阱　出处：《吉林大学》2017年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：细胞自噬(Autophagy)即真核细胞中进化上高度保守、用于将细胞内衰老、变性或受损的细胞器及蛋白质运送到溶酶体进行消化并降解的过程。根据其降解底物及形成方式不同分为巨自噬,微自噬及分子伴侣自噬。它们在体内的发生机制以及功能不尽相同。自噬的发生要受到自噬相关基因以及相关蛋白的调控,目前在酵母细胞中已有超过36个自噬相关基因(Autophagy-related gene,ATG)被发现,且在哺乳动物细胞中大多数都存在其同源基因。自噬相关蛋白是由自噬基因编码的,他们相互联系构成了自噬过程的核心分子机制,并参与了多种自噬过程的调控。近些年来,多种自噬相关通路已经被发现。胞外陷阱(Extracelluar Traps,ETs)是由细胞核DNA构成的纤维网状结构组成,可以用来限制病原微生物的活动,并通过聚集在纤维网上的颗粒蛋白来杀灭病原微生物的一种新型细胞天然免疫机制。它是一种不同于凋亡和坏死新型的细胞死亡形式,是在免疫细胞中发生的一种独特的抵抗感染和毒物入侵的的自我保护方式。目前发现能够诱导ETs的微生物包括细菌、真菌和寄生虫等,但真菌毒素是否能够诱导该机制尚未见报道。黄曲霉毒素B1(Aflatoxin,AFB1)是目前发现的真菌类毒素中毒性最大、污染范围最广的毒素之一,微量AFB1能造成很大的伤害。关于AFB1在体内的作用机制已经成为国内外热点研究的问题。因此,本研究以巨噬细胞为模型细胞,考察AFB1是否能够引起细胞自噬、ROS以及胞外陷阱产生,并在分子作用机制层面深入探讨AFB1诱导的自噬、ROS和胞外陷阱之间的关系。首先,我们考察了AFB1对巨噬细胞自噬的诱导情况。利用荧光显微镜对AFB1作用下的鼠源性巨噬细胞RAW264.7细胞GFP-LC3以及ptf-LC3(GFP-LC3和RFP-LC3串联)的表达水平进行观察;利用western blot技术对RAW264.7细胞和人源性巨噬细胞THP-1细胞的自噬标记蛋白LC3、P62以及自噬相关通路蛋白Beclin1、ERK、P-ERK、P-MEK的表达水平进行检测;并通过自噬抑制剂氯喹(CQ)观察AFB1诱导的自噬是否为完全自噬,以及通过MEK抑制剂PD98059观察Beclin1、MEK、ERK与自噬之间的关系。结果显示,AFB1能够诱导细胞中GFP-LC3斑点增多,能够使LC3蛋白的表达水平增加,且P62蛋白因被降解的量增加从而表达水平显著降低,说明AFB1能够诱导巨噬细胞自噬的发生;AFB1能够诱导细胞内ptf-LC3斑点的表达且RFP-LC3斑点显著强于GFP-LC3,CQ能够显著抑制LC3的降解过程,说明AFB1诱导的自噬为完全自噬;AFB1能够诱导Beclin1蛋白的表达以及MEK、ERK的磷酸化,且PD98059能够抑制Beclin1、LC3蛋白的表达及MEK、ERK的磷酸化过程,说明AFB1诱导的巨噬细胞自噬是通过MEK、ERK的途径实现的并与Beclin1相关。综上所述,AFB1诱导了人源性和鼠源性巨噬细胞自噬,该自噬为完全自噬,由MEK、ERK通路介导并受Beclin1调节。其次,我们分析了AFB1诱导巨噬细胞ROS和胞外陷阱产生的情况。我们利用荧光酶标仪对经AFB1作用的RAW264.7细胞和THP-1细胞的ROS以及胞外DNA的产量进行了检测;利用荧光显微镜对经AFB1处理的THP-1细胞产生的胞外陷阱的结构进行观察及其组分进行了共定位。结果显示,AFB1能够诱导RAW264.7细胞和THP-1细胞中ROS的产量呈时间及浓度依赖性增加并受NOX2抑制剂DPI抑制,且胞外DNA的表达水平呈浓度依赖性增加;胞外陷阱的形态随浓度的增加而发生变化,组蛋白H3、弹力蛋白酶和髓过氧化物酶是巨噬细胞胞外陷阱的组成成分。综上所述,这些结果表明AFB1诱导巨噬细胞ROS的产生且具有NOX2依赖性,AFB1能够诱导胞外陷阱的产生且其结构与嗜中性粒细胞胞外陷阱(Neutrophil extracellular traps,NETs)相似,而组蛋白H3、髓过氧化物酶、弹力蛋白酶为胞外陷阱的主要组成成分。最后,我们在分子作用机制层面探究了AFB1诱导的自噬、ROS和胞外陷阱之间的关系。利用荧光显微镜对经AFB1处理的THP-1细胞的胞外陷阱的产生进行观察,并用NOX2氧化酶抑制剂DPI、自噬抑制剂渥曼霉素研究ROS,自噬与胞外陷阱之间的关系;利用荧光酶标仪对经PMA作用的THP-1细胞ROS的产量进行了检测,研究ROS与胞外陷阱之间的关系;利用western blot技术检测THP-1细胞的LC3的表达水平,并用NOX2氧化酶抑制剂DPI、自噬抑制剂渥曼霉素处理研究ROS与自噬之间的关系;最后用ELISA技术检测巨噬细胞胞外陷阱对AFB1的降解水平。结果显示,NOX2氧化酶抑制剂DPI以及自噬抑制剂渥曼霉素均抑制了细胞胞外陷阱的产生,说明胞外陷阱的形成依赖于NOX2产生的ROS以及自噬的发生;NOX2氧化酶抑制剂DPI能够显著地抑制细胞LC3的表达水平,说明AFB1诱导的巨噬细胞自噬受到ROS的调节;AFB1在诱导胞外陷阱产生的同时本身也得到了显著地降解。综上所述,AFB1诱导NOX2依赖性的ROS的产生来诱导巨噬细胞胞外陷阱的形成,ROS通过调节自噬从而调节胞外陷阱的产生,且巨噬细胞胞外陷阱的产生具有降解AFB1的作用。总之,本研究结果表明,AFB1能够诱导巨噬细胞RAW264.7和THP-1发生完全自噬,且该自噬是通过激活MEK/ERK途径以及上调Beclin1来实现的。AFB1通过诱导自噬以及NOX2依赖性的ROS的产生来诱导巨噬细胞RAW264.7和THP-1胞外陷阱的形成。而且AFB1诱导的ROS产生在自噬发生的上游,对自噬具有调节作用。更重要的是,AFB1诱导胞外陷阱产生的同时本身也得到了显著地降解。这些结果将为今后以自噬及胞外陷阱为靶标开发新的抗AFB1的药物提供新思路。
[Abstract]:Autophagy - related gene ( ATG ) has been found to be the core molecular mechanism of autophagy , which is different from apoptosis and necrosis . In conclusion , AFB1 was able to induce the production of ROS in RAW264.7 cells and THP - 1 cells and to be regulated by Beclin1 . The results showed that AFB1 could induce the production of ROS in RAW264.7 cells and THP - 1 cells . In conclusion , AFB1 can induce autophagy of macrophages RAW264.7 and THP - 1 . In conclusion , AFB1 can induce the formation of RAW264.7 and THP - 1 extracellular traps by activating MEK / ERK pathway and up - regulation Beclin1 .

【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S859.8

【参考文献】