副猪嗜血杆菌感染猪肺泡巨噬细胞的转录组学分析

发布时间：2018-03-18 17:13

本文选题：副猪嗜血杆菌　切入点：猪肺泡巨噬细胞3D4/21　出处：《华中农业大学》2017年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,H.parasuis)是定殖于猪上呼吸道的一种条件致病菌,在应激或免疫抑制病原混合感染时,可引起以纤维素性浆膜炎、关节炎、脑膜炎和肺炎为特征的格拉瑟氏病(Gl?sser’s disease),给养猪业带来巨大损失。猪肺泡巨噬细胞作为天然免疫细胞的重要组成部分,通过介导吞噬杀伤、产生活性氧及活性氮类来杀伤病原和释放一些细胞因子和趋化因子聚集中性粒细胞等免疫细胞到感染部位发挥免疫功能。本课题从副猪嗜血杆菌感染宿主肺泡巨噬细胞的角度,使用RNA-seq技术,首次对强弱毒力副猪嗜血杆菌体外感染猪肺泡巨噬细胞传代细胞系3D4/21的转录组进行分析。结果如下:1.SH0165和HPS1712的抗吞噬能力和诱导细胞因子表达的比较将副猪嗜血杆菌SH0165和HPS1712以10个MOI与猪肺泡巨噬细胞3D4/21互作8h,发现HPS1712的吞噬率显著高于SH0165,说明SH0165抗吞噬能力强于HPS1712。将SH0165和HPS1712与3D4/21细胞互作,然后检测细胞因子mRNA的表达,发现在8h时SH0165感染组产生IL-1α、IL-6、IL-8、IL-10表达水平高于HPS1712感染组。而在12h、24h时HPS1712感染组IL-1α、IL-6表达水平高于SH0165感染组。通过吞噬实验和细胞因子的检测,确定SH0165和HPS1712感染剂量为10个MOI。2.副猪嗜血杆菌感染3D4/21细胞差异表达基因筛选和功能聚类分析本研究采用SH0165,Nagasaki,SW114,HPS1712以10个MOI体外感染猪传代肺泡巨噬细胞3D4/21,在感染后8h进行全转录组表达谱分析,结果显示:SH0165,Nagasaki,SW114,HPS1712感染组中分别有542,502,662,37个差异表达基因,其中分别包括283,336,359,34个上调表达基因和259,166,303,3个下调表达基因,并对这些差异表达基因进行了功能聚类分析。3.差异表达基因的生物进程和信号通路富集分析通过对四组差异表达基因进行注释、生物进程和信号通路富集分析,发现这些基因主要与转录因子,基因表达,细胞分化,炎症反应,免疫反应,细胞凋亡,信号转导等生物进程有关,信号通路富集分析发现:细胞因子与细胞因子受体相互作用、细胞凋亡、趋化因子信号通路、NF-k B、p53和MAPK信号通路、NOD样受体信号通路、Toll样受体信号通路等通路聚集程度较高。对这些差异表达基因功能和信号通路富集分析表明机体通过不同的免疫反应策略来对抗H.parasuis感染。另外,强毒力菌株感染组的差异表达基因主要与细胞因子和趋化因子产生、转录因子、精氨酸酶活性等生物进程有关。弱毒力菌株感染组的差异表达基因主要与转录调节因子,信号转导、吞噬体形成等功能有关。4.差异表达基因的验证为了验证RNA-seq数据的准确性,我们利用荧光定量PCR技术对不同信号通路中的基因,特别是细胞因子与细胞因子受体互作通路中基因进行了验证。其中包含22个上调差异表达基因,6个下调差异表达基因。荧光定量PCR验证差异表达基因的结果与RNA-seq中差异表达基因的结果在趋势上基本一致,说明RNA-seq结果是可靠的。5.IL-19的功能验证通过对副猪嗜血杆菌感染3D4/21细胞后IL-19的mRNA和蛋白水平表达检测、siRNA和过表达实验和仔猪感染实验发现并证实了IL-19与副猪嗜血杆菌病有关且抑制IL-1α和IL-8。
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【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S858.28

【参考文献】