禾谷丝核菌（Rhizoctonia cerealis）rDNA-ITS序列异质性分析

发布时间：2018-03-26 22:39

本文选题：禾谷丝核菌　切入点：ITS　出处：《山东农业大学》2017年硕士论文

【摘要】：小麦纹枯病又称小麦尖眼点病(Wheat sharp eyespot),是分布地域广泛的土传性真菌病害,几乎遍及世界各温带小麦种植地,且危害范围呈逐年扩大的趋势。小麦纹枯病的病原为禾谷丝核菌(Rhizoctonia cerealis),该菌在自然和人工条件下都难以产生无性或有性态的孢子,且细胞核为同质核还是异质核,目前尚无定论。这都严重制约着该病菌的分子遗传学和相关致病机制的研究。禾谷丝核菌的rDNA-ITS异质性虽有报道,但对其异质性规律及原因尚未详细探讨。本研究利用三株地理来源不同的禾谷丝核菌为供试材料,采用原生质体制备技术,获得原生质体再生菌落(single-protoplast isolate,SPI),对多个再生菌落的ITS区进行测序,利用相关生物信息学软件对ITS多序列进行比对分析,寻找禾谷丝核菌ITS序列多态性的变化规律,并探究ITS序列多态性是否与R.cerealis细胞核异质性有关。主要研究结果如下:1.通过原生质体制备技术,成功获得供试菌株WK-207、WK-137、WK-159的多个SPIs,分别为42、8、4。利用PDA培养基分别对不同的SPIs进行25℃恒温培养,并利用4',6'二氨基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylidole,DAPI),进行细胞核荧光染色,观察核相。结果显示,SPIs与原始菌株在菌落形态、菌丝形态以及核相等方面均无差异。2.本研究从来自3个原始菌株的54个SPIs菌株中共获得169条ITS序列,其中WK-207菌株共获得89条,WK-137菌株共获得50条,WK-159菌株共获得30条。分析结果表明,来自三株不同菌株的SPIs的ITS序列在长度、GC含量以及单核苷酸多态位点(Single Nucleotide Polymorphism,SNP)的位置及类型上均存在差异;对来自同一菌株的SPIs的ITS序列进行分析,发现这种差异既发生在同一菌株的不同SPIs菌株间,也存在于同一SPIs的不同ITS序列拷贝之间。3.对ITS多序列比对发现,ITS1区与ITS2区存在不同的变异速率。在禾谷丝核菌WK-207、WK-137、WK-159中,ITS2区存在的单核苷酸多态位点数量普遍多于ITS1区,即ITS2区变异频率大于ITS1区;相较于ITS2区,ITS1区却更容易发生碱基的插入或缺失,即片段长度多态性;就碱基变异类型而言,碱基转换的频率明显高于碱基颠换的频率。4.为进一步探究ITS区序列的多态性与禾谷丝核菌细胞核异质性的关系,本研究以WK-207所得的89个ITS序列进行比对分析,结果发现89条ITS序列绝大部分聚集于系统进化树两端,且遗传距离相对较远,被明显分为两组。因此,ITS区序列的异质性可能与禾谷丝核菌细胞核的异质性存在相关性。5.利用DNAMAN 8.对ITS序列进行一致性分析,结果发现三个供试菌株的ITS区序列相似性均高达99%以上。依据rDNA-ITS序列构建Neighbor-Joining系统发育树,结果表明169条ITS序列均聚集于AG-DI融合群分支,与其它双核丝核菌的融合群存在较远的遗传距离。因此,虽然禾谷丝核菌的ITS序列存在异质性,但依然具有较高的一致性,而且不影响利用ITS序列进行丝核菌的融合群鉴定,甚至在区分融合亚群方面,ITS序列依然具有较高的准确度。本研究利用原生质体制备技术分析了禾谷丝核菌ITS区序列的异质现象,不同菌株其多态性变化的位点不同,同一菌株其多态性位点的变化也具有一定的规律性,同一菌株ITS区序列的变化与禾谷丝核菌细胞核的异质性有明显的相关性,但禾谷丝核菌ITS区序列的变化并不影响其在融合群甚至融合亚群的划分中的应用。
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【学位授予单位】：山东农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S435.121.4

【参考文献】