兰州百合蔗糖代谢关键酶基因的克隆及原核表达

发布时间：2018-03-31 11:30

  本文选题：兰州百合　切入点：蔗糖合成酶　出处：《沈阳农业大学》2017年硕士论文

【摘要】：淀粉含量是决定百合种球质量的最关键因素。蔗糖作为百合鳞茎中可溶性碳水化合物的主要形态,可在蔗糖合成酶(Sucrose Synthase,SuSy)和可溶性酸性转化酶(Soluble Acid Invertase,SAI)调控下参与淀粉合成。为探究百合SuSy和SAI的基因功能及其在蔗糖-淀粉代谢途径中的调节机理,本研究首先克隆得到兰州百合(Lilium davidiivar.unicolor)两个SuSy基因SuSy1和SuSy2的全长cDNA序列,并对其序列进行了生物信息学分析,将其过表达载体和RNAi载体通过农杆菌介导转化兰州百合。而后构建了兰州百合SuSy及SAI基因的原核表达载体,并在适宜条件诱导融合蛋白表达,为进一步研究百合SuSy和SAI基因功能奠定了基础。主要研究结果如下:1.SuSy1和SuSy2基因cDNA全长克隆及生物信息学分析以兰州百合扦插鳞片的总RNA为模板,采用RT-PCR及RACE法成功克隆获得SuSy基因SuSy1和SuSy2全长cDNA序列,其长度分别为2,877 bp和2,865 bp.序列分析结果显示,基因SuSy1和SuSy2的同源性为85.73%,与同科植物同源性为65%-88%,分别编码807和810个氨基酸,其蛋白等电点均为6.10.结构域分析表明,SuSy1和SuSy2均编码含有188个氨基酸的保守结构域,其中包含一个糖基转移酶结构域,与糖基转化酶家族GT1有很高的相似性。2.SuSy基因转化兰州百合研究利用农杆菌介导转化法,将带有兰州百合SuSy1和SuSy2基因的过表达载体和RNAi载体导入兰州百合。为优化遗传转化过程,进行了兰州百合小鳞片对潮霉素(Hyg)和头孢霉素(Cef)浓度敏感试验,并对影响转化的各因素进行筛选。获得最适条件为:20 mg L-1 Hyg为抗性芽筛选的适宜浓度;300 mg L-1 Cef为最适抑菌浓度;预培养2 d,农杆菌菌液培养至OD600为0.6,侵染鳞片20 min,重悬液和共培养基中加入终浓度为100 μM的乙酿丁香酮(AS),共培养3 d.最终获得了 3株带有基因SuSy2片段的RNAi载体的转基因抗性苗,目前正处于筛选阶段。3.构建原核表达载体及基因原核表达利用双酶切法,将兰州百合SuSy基因SuSy1、SuSy2和SAI基因SAI的ORF序列与原核表达载体pET28a酶切并连接,构建了原核表达载体pET-28a-SuSy1、pET-28a-SuSy2和pET-28a-SAI.将获得的重组质粒转化入原核表达菌株BL21(DE3),加入IPTG诱导,且从诱导温度和IPTG浓度方面获得适宜诱导条件,经SDS-PAGE电泳检测,结果表明,目的基因得到的融合蛋白与试验预期的大小相一致,可以初步认定SuSy和SAI基因在原核中获得表达。
[Abstract]:Starch content is the most important factor to determine the quality of lily bulb. Sucrose is the main form of soluble carbohydrate in lily bulb. Under the regulation of sucrose synthase Sucrose Synthase SuSyand soluble acid invertase (Soluble Acid InvertaseSae), starch synthesis could be involved in starch synthesis. In order to study the gene function of SuSy and SAI and its regulation mechanism in sucrose-starch metabolism, In this study, the full-length cDNA sequences of two SuSy genes, SuSy1 and SuSy2, were first cloned from Lilium davidiivar.unicolor, and their sequences were analyzed by bioinformatics. The overexpression vector and RNAi vector were transformed into Lanzhou lily by Agrobacterium tumefaciens. The prokaryotic expression vector of SuSy and SAI gene was constructed, and the fusion protein expression was induced under suitable conditions. The main results are as follows: 1. The full-length cloning of SuSy1 and SuSy2 gene cDNA and bioinformatics analysis were based on the total RNA of cuttage scale of Lanzhou Lily. The full-length cDNA sequences of SuSy gene SuSy1 and SuSy2 were successfully cloned by RT-PCR and RACE. The length of cDNA was 2877 BP and 2865 BP, respectively. The results showed that the homology of SuSy1 and SuSy2 was 85.73, and the homology of SuSy1 and SuSy2 was 65-88, encoding 807 and 810 amino acids, respectively. The protein isoelectric point is 6.10.The domain analysis shows that SuSy1 and SuSy2 both encode a conserved domain containing 188 amino acids, including a glycosyltransferase domain. SuSy gene was transformed into Lanzhou lily by Agrobacterium tumefaciens mediated transformation. The overexpression vector and RNAi vector containing SuSy1 and SuSy2 genes were introduced into Lanzhou lily. In order to optimize the genetic transformation process, the suSy gene was transformed into Lilium Lanzhou by Agrobacterium tumefaciens (Agrobacterium tumefaciens). The sensitivity test of Lilium lilium scale to hygromycin (Hyg) and cefomycin (Cef) concentration was carried out, and the factors affecting transformation were screened. The optimum conditions were as follows: 1. 20 mg L-1 Hyg was the optimum concentration for screening resistant buds, and 300 mg L-1 Cef was the optimum inhibitory concentration. After 2 days of pre-culture, Agrobacterium tumefaciens were cultured to OD600 0.6, infecting scales for 20 min, adding 100 渭 M final concentration of eugenone to the culture medium for 3 days. Finally, three RNAi vectors with gene SuSy2 fragment were obtained. Transgenic resistant seedlings, At present, the prokaryotic expression vector and prokaryotic expression vector were constructed. The ORF sequences of SuSy gene SuSy1SuSy2 and SAI gene SAI were digested and ligated with the prokaryotic expression vector pET28a by double enzyme digestion. The prokaryotic expression vectors pET-28a-SuSy1, pET-28a-SuSy2 and pET-28a-SAI. were transformed into the prokaryotic expression strain BL21DE3 and induced by IPTG. The suitable induction conditions were obtained from the induction temperature and the concentration of IPTG. The results of SDS-PAGE electrophoresis showed that, The fusion protein obtained from the target gene was consistent with the expected size of the experiment, and the expression of SuSy and SAI genes in prokaryotic cells could be preliminarily identified.
【学位授予单位】：沈阳农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S682.29

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