IGF1和TIMP1对绒山羊毛乳头细胞发育过程中相关信号通路的调控研究

发布时间：2018-04-03 20:20

本文选题：IGF1　切入点：TIMP1　出处：《内蒙古大学》2017年硕士论文

【摘要】：毛乳头细胞是毛囊的一种真皮源细胞,位于毛囊基底部,对毛囊的发育和再生起着决定性的作用。绒山羊皮肤中存在初级和次级两种毛囊,它们对应的毛乳头细胞分别称为初级毛乳头细胞和次级毛乳头细胞。初级和次级毛乳头细胞对毛发的生长有着不同的作用,初级毛乳头细胞控制羊毛的生长,次级毛乳头细胞控制羊绒的生长。毛发生长和毛囊发育是一个的复杂的调控过程,它是多条信号通路共同作用的结果。在之前的研究中发现,毛囊细胞中的PI3K/AKT和ERK1/2信号通路被激活,能加速毛囊从休止期向生长期转变,延长毛囊的生长期,促进毛囊发育和毛发生长。IGF1和TIMP1能够直接和间接的对AKT、ERK1/2信号通路进行调节。本研究选取IGF1和TIMP1基因作为研究对象,探讨两种基因在初级和次级毛乳头细胞中对AKT和ERK1/2信号通路的调节作用,为进一步研究绒山羊初级和次级毛乳头细胞对毛囊发育和毛发再生的作用提供实验依据。1.毛乳头细胞中IGF1、TIMP1、AKT和ERK1/2信号通路及相关基因的表达情况本研究以初级和次级毛乳头细胞为原料,观察初级和次级毛乳头细胞的生长状态。通过Realtime-PCR技术检测IGF1、TIMP1及AKT和ERK1/2信号通路相关基因的mRNA水平。结果显示,初级毛乳头细胞中IGF1、TIMP1、MMP9和PTEN基因的mRNA表达水平较次级毛乳头细胞中高,分别为18、2.1、9、1.9倍,初级毛乳头细胞中VEGF和KDR基因的mRNA表达水平较次级毛乳头细胞中低,分别为0.71、0.08倍;通过Western Blot技术检测初级和次级毛乳头细胞中IGF1、TIMP1、AKT和ERK1/2的蛋白表达量和AKT、ERK1/2的磷酸化水平。结果显示,初级毛乳头细胞中IGF1和TIMP1的蛋白表达量较次级毛乳头细胞中高,分别为2、1.9倍,初级毛乳头细胞中AKT和ERK1/2的蛋白表达量与次级毛乳头细胞比没有显著差异,分别为1.02、1.01倍。初级毛乳头细胞中ERK1/2的蛋白磷酸化水平是次级毛乳头细胞的0.4倍,初级毛乳头细胞中AKT的蛋白磷酸化水平是次级毛乳头细胞的4.6倍。2.载体构建和转染分析通过PCR技术克隆IGF1和TIMP1基因的CDS序列,以pIRES2-EGFP为骨架载体,构建了 PIRES2-EGFP-IGF1和pIRES2-EGFP-TIMP1过表达载体,构建了 IGF1-14、IGF1-428、TIMP1-126、TIMP1-173 和 TIMP1-510 五个干扰载体。将过表达和干扰载体通过电转染的方法转染到绒山羊初级毛乳头细胞中,运用Real time-PCR技术检测IGF1和TIMP1过表达和干扰效率。结果显示,与对照组相比,IGF1和TIMP1的过表达效率分别为4.8和2倍,IGF1-14和TIMP1-173载体的干扰效果最好,干扰效率分别为0.54、0.39倍。3.IGF1和TIMP1对AKT和ERK1/2信号通路及相关基因的表达情况将过表达载体 pIRES2-EGFP-IGF1、pIRES2-EGFP-TIMP1 和干扰载体IGF1-14、TIMP1-173分别转染到初级和次级毛乳头细胞中,48小时后收集细胞样品,提取RNA和蛋白质,通过实时定量PCR技术检测IGF1、TIMP1及AKT和ERK1/2信号通路相关基因的mRNA水平,蛋白免疫印迹技术检测IGF1、TIMP1、AKT和ERK1/2的表达水平及AKT和ERK1/2的蛋白磷酸化水平,结果显示:3.1毛乳头细胞中IGF1及相关基因的转录表达水平:在IGF1过表达的初级毛乳头细胞中,AKT和ERK1/2的转录水平升高,分别是对照组细胞的1.35、1.47倍。VEGF的转录水平降低,是对照组细胞的0.43倍。IGF1干扰的初级毛乳头细胞中,AKT和ERK1/2的转录水平降低,分别是对照组细胞的0.60、0.71倍。VEGF的转录水平降低,是对照组细胞的0.56倍。IGF1过表达的次级毛乳头细胞中,AKT和ERK1/2的转录水平降低,分别是对照组细胞的0.73、0.67倍。VEGF的转录水平是对照组细胞的0.40倍。IGF1干扰的次级毛乳头细胞中,AKT和ERK1/2的转录水平升高,分别是对照组细胞的1.45、1.51倍。VEGF的转录水平是对照组细胞的0.84倍。结果表明,在初级毛乳头细胞中,IGF1促进AKT和ERK1/2的转录,然而在次级毛乳头细胞中,IGF1抑制AKT和ERK1/2的转录。在初级和次级毛乳头细胞中,IGF1的过表达和干扰都抑制了 VEGF的转录。3.2毛乳头细胞中IGF1及相关基因的蛋白磷酸化水平:与对照组细胞相比,在IGF1过表达的初级毛乳头细胞中,AKT和ERK1/2的蛋白磷酸化水平分别为1.72、1.61倍,而IGF1-干扰组分别是2.10、1.52倍。在次级毛乳头细胞中,与对照组细胞相比,IGF1过表达组AKT和ERK1/2的蛋白磷酸化水平分别为4.23、0.62倍,而IGF1干扰组分别是5.68、0.78倍。结果表明,IGF1的过表达和干扰都能够上调初级和次级毛乳头细胞中AKT的磷酸化水平。在初级毛乳头细胞中IGF1的过表达和干扰都提高了 ERK1/2的磷酸化水平,而在次级毛乳头细胞中IGF1的过表达和干扰都抑制了 ERK1/2的磷酸化作用。3.3 毛乳头细胞中TIMP1及相关基因的转录表达水平:在TIMP1过表达的初级毛乳头细胞中,VEGF、KDR、MMP9和PTEN的转录水平降低,分别是对照组细胞的0.73、0.65、0.58、0.45倍。TIMP1干扰的初级毛乳头细胞中,VEGF、KDR、MMP9和PTEN的转录水平升高,分别是对照组细胞的1.26、1.54、1.09、1.05倍。TIMP1过表达的次级毛乳头细胞中,VEGF、MMP9、KDR和PTEN的转录水平降低,分别是对照组细胞的0.33、0.21、0.28、0.47倍。TIMP1干扰的次级毛乳头细胞中,VEGF、KDR、MMP9和PTEN的转录水平升高,分别是对照组细胞的1.05、1.35、1.38、1.95倍。结果表明,在毛乳头细胞(初级和次级)中,TIMP1抑制MMP9、VEGF、KDR和PTEN的转录。3.4毛乳头细胞中TIMP1及相关基因的蛋白磷酸化水平:在TIMP1过表达的初级毛乳头细胞中,AKT和ERK1/2的蛋白磷酸化水平分别是对照组细胞的0.6、2.1倍,TIMP1干扰的初级毛乳头细胞中,AKT和ERK1/2的蛋白磷酸化水平分别是对照组细胞的1.5、6.4倍。TIMP1过表达的次级毛乳头细胞中,AKT和ERK1/2的蛋白磷酸化水平分别是对照组细胞的0.7、0.63倍,TIMP1干扰的次级毛乳头细胞中,AKT和ERK1/2的蛋白磷酸化水平分别是对照组细胞的1.4、0.8倍。结果表明,在初级和次级毛乳头细胞中,TIMP1抑制AKT的蛋白磷酸化水平,在初级毛乳头细胞中,TIMP1的过表达和干扰都促进了 ERK1/2的磷酸化水平,在次级毛乳头细胞中,TIMP1的过表达和干扰都抑制了 ERK1/2的磷酸化水平。上述结果表明:在初级毛乳头细胞中,IGF1和TIMP1的过表达和干扰会激活ERK1/2信号通路;在次级毛乳头细胞中,IGF1和TIMP1的过表达和干扰都抑制ERK1/2信号通路。在初级和次级毛乳头细胞中,IGF1表达量的升高和降低都可以上调激活AKT信号通路,而TIMP1则对AKT信号通路主要起到负调控作用。
[Abstract]:The expression of IGF - 1 , TIMP1 , MMP - 9 and IL - 2 in primary and secondary hair papilla cells was investigated . The results showed that the expression of IGF - 1 , TIMP1 , MMP - 9 and ERK in primary and secondary hair papilla cells was significantly lower than that in secondary - hair papilla cells . The expression levels of IGF1 , TIMP1 , ERK and ERK 1 / 2 were detected by real - time quantitative PCR . The levels of protein phosphorylation of IGF1 , TIMP - 1 , 1 / 2 in the primary and secondary dermal papilla cells were significantly higher than those in the control group .

【学位授予单位】：内蒙古大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S827

【参考文献】