PID1对猪肌内前体脂肪细胞增殖和分化的影响

  本文关键词：PID1对猪肌内前体脂肪细胞增殖和分化的影响，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：磷酸酪氨酸互作结构域1(Phosphotyrosine interaction domain containing 1, PID1)是一个近期发现的在肥胖者腹膜后脂肪组织中高表达的基因,后续研究发现该基因参与胰岛素抵抗,并且可能与脂质代谢有关。相关性分析发现,不同肌内脂肪含量的猪PID1表达量与肌内脂肪的沉积呈显著正相关。因此,PID1可能是影响肌内脂肪沉积的候选基因。本研究以猪肌内前体脂肪细胞为研究对象,探讨PID1基因对猪肌内前体脂肪细胞增殖和分化的影响,主要研究内容及结果如下：1.猪PIDl基因原核表达、纯化、多克隆抗体制备及组织表达谱分析以pET28a(+)为载体,大肠杆菌BL21(DE3)为宿主菌表达猪.PID1基因CDS区和组氨酸标签融合的重组蛋白。SDS-PAGE显示表达出的蛋白分子量约32 kDa,经过表达条件的优化,重组蛋白能够在30。C、经0.1mmol/LIPTG诱导4h得到高效表达,表达量达到宿主菌总蛋白的60%。溶解性分析表明重组蛋白主要以包涵体形式存在。包涵体使用6 mol/L盐酸胍溶解后,使用亲和层析法进行纯化,最终重组蛋白浓度达到了1.6mg/mL,并且SDS-PAGE检测可见单一条带。对纯化后的蛋白进行质谱鉴定,结果表明纯化的重组蛋白为猪PID1蛋白。重组蛋白经稀释法复性后处理增殖中的3T3-L1前体脂肪细胞,发现该蛋白能促进3T3-L1前体脂肪细胞增殖,表明复性后的蛋白具有生物学活性。另外,本研究用纯化后的蛋白多次免疫SD大鼠的方法制备多克隆抗体。多克隆抗体的效价和特异性分别用间接酶联免疫反应和Western Blot鉴定。ELISA结果表明,制备的多克隆抗体滴度达1：20480；Western Blot结果显示该多克隆抗体能够特异性识别PID1蛋白,表明多克隆抗体制备成功,这将为研究PID1的功能提供一个很好的工具。以10周龄DLY猪为研究对象,使用自制的多克隆抗体检测了PIDl基因在腰大肌、趾长伸肌、脂肪、背最长肌、肾、肺、脾、肝脏和心脏中的表达情况,发现PID1蛋白主要表达于肌肉组织,其次是肝脏。这表明PID1可能影响脂质代谢,尤其可能影响肌肉组织中脂质代谢。因此,PID1可能是影响肌内脂肪沉积的候选基因。2.PID1对猪肌内前体脂肪细胞增殖和分化的影响哺乳动物肌内脂肪的80%以上存储于肌内脂肪细胞中,因此本试验探讨了PID1对猪肌内前体脂肪细胞增殖和分化的影响。首先,采用差数贴壁法从3日龄DLY猪背最长肌中分离肌内前体脂肪细胞,免疫荧光检测前脂肪细胞特异性基因Pref-1的表达,结果发现几乎100%细胞表达Pref-1:同时油红O染色结果显示本试验分离的细胞能够分化为成熟脂肪细胞。其次,采用添加猪PID1重组蛋白和转染PID1过表达载体pcDNA3.1(+)-pPID1两种方法,探讨PID1对猪肌内前体脂肪细胞增殖的影响。结果发现重组猪PID1蛋白处理以及转染pcDNA3.1(+)-pPID1均能促进猪肌内前体脂肪细胞的增殖。最后,为了研究PID1对猪肌内前体脂肪细胞分化的影响,处理组细胞转染0.5 μg pcDNA3.1(+)-pPID 1,对照组转染等量的pcDNA3.1(+),诱导分化8 d之后检测脂肪细胞分化相关基因的表达。结果表明PID1过表达显著上调脂肪细胞分化主要转录因子C/EBPα、PPARγ的mRNA水平和蛋白水平,并且显著上调脂肪细胞分化早期标志基因LPL的mRNA水平,这表明PID1能促进猪肌内前体脂肪的分化。综上所述,本研究首次用原核表达系统、亲和层析纯化以及稀释复性的方法制备了具有生物学活性的猪PID1重组蛋白及其多克隆抗体；用制备的多克隆抗体检测猪PID1组织表达情况,发现PID1蛋白主要表达于肌肉组织和肝脏,表明PID1可能是影响肌内脂肪沉积的候选基因；通过转染猪PID1重组质粒或添加猪PID1重组蛋白于猪肌内前体脂肪细胞,探讨PID1对猪肌内前体脂肪细胞增殖和分化的影响,首次提供了PID1促进猪肌内前体脂肪细胞增殖和分化的依据。

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