草莓茎尖超低温疗法脱毒技术体系的建立

发布时间：2017-03-22 12:04

  本文关键词：草莓茎尖超低温疗法脱毒技术体系的建立，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：草莓(Fragaria×ananassa Duch.)是蔷薇科(Rosaceae)草莓属(Fragaria)多年生草本植物。其果实鲜嫩多汁、色泽艳丽、香气怡人、口感酸甜适中,是我国传统的优秀浆果果品之一。其繁殖主要采用传统的分株繁殖或匍匐茎埋压,这种无性繁殖的方式提高了病毒侵染植株的几率。避免病毒给生产带来巨大的经济损失,实现草莓无病毒苗栽培生产化,必将是我国草莓业目前势在必行的发展趋势和目标。而超低温疗法是一种新型、高效脱除植物病毒的新技术,备受各研究科学者的亲睐。本试验以‘红颜’草莓(Fragaria×ananassa Duch.cv. Benihoppe)品种大田茎尖为试验材料,对超低温疗法关键程序(预培养、预处理和化冻条件)进行了筛选和优化,并以茎尖脱毒法为对照,建立起完善的超低温疗法脱毒技术体系。在此基础上,研究者对多重RT-PCR病毒检测体系相关参数(Mg2+浓度、引物浓度、PCR程序等)进行了优化和改进,以期建立完善的多重RT-PCR病毒检测体系。最后利用DNA相关软件筛选分析SSR-PCR引物,分析超低温疗法脱毒苗遗传性状的稳定性,实验结果如下：1.适合‘红颜’草莓苗的超低温疗法脱毒技术体系为：在含0.3 mo.L一预培养基上暗培养7 d,室温下LS装载60 min,0℃下PVS2脱水1 h,液氮处理1 h,40℃水浴化冻120 s,用含1.2 mol·L-1蔗糖的液体MS培养基洗涤两次,每次10 mmin。该体系同时脱除草莓四种主要病毒(草莓镶脉病毒、草莓轻型黄边病毒、草莓皱缩病毒和草莓斑驳病毒)的比率高达100%,成活率为69.03%。将该体系再用于‘蜀丰’‘丰香’以及‘章姬’,其存活率分别为68.15%、71.00%和69.78%,达到预期的试验目标。2.适用于多重RT-PCR检测体系的引物是SC1/SC2、SM1/SM2、SY1/SY2、 SV1/SV2、A1/A2,目的片段大小分别是345 bp、394 bp、861 bp、271 bp和295 bp；多重RT-PCR病毒检测体系是1μl cDNA、2 μl 10×PCR bufer、2.0 mmol·L-1 MgCl2、 0.2 mmol·L-1 dNTPs、0.5UTaq酶,引物浓度0.2 μmol·L-1 (SCV 0.25 μmol·L/1),最后用超纯水补至20μl; PCR程序：94℃预变性3 min,94℃变性1 min,55℃退火40 s,68℃延伸40s,35个循环,72℃再延伸5 min。
【关键词】：草莓 茎尖 超低温疗法 多重PCR
【学位授予单位】：四川农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S668.4
【目录】：

• 摘要4-5
• Abstract5-9
• 1. 文献综述9-17
• 引言9-10
• 1.1 超低温疗法的研究进展10-11
• 1.2 超低温疗法的原理11-12
• 1.3 冷冻疗法操作程序12-15
• 1.3.1 材料选择13
• 1.3.2 材料预培养13
• 1.3.3 材料预处理13-14
• 1.3.4 化冻和洗涤14-15
• 1.4 四种常见草莓病毒检测方法的研究15-16
• 1.4.1 指示植物小叶嫁接法检测15
• 1.4.2 血清学检测15
• 1.4.3 分子生物学检测15-16
• 1.5 超低温疗法后再生植株遗传稳定性的检测16-17
• 2. 材料与方法17-25
• 2.1 材料17-19
• 2.1.1 植物材料17
• 2.1.2 试验试剂和溶液17-18
• 2.1.3 主要仪器设备18-19
• 2.2 技术路线19
• 2.3 试验方法19-25
• 2.3.1 超低温疗法脱毒技术体系的建立19-22
• 2.3.2 病毒检测体系的建立22-25
• 2.3.3 草莓脱毒效果检测25
• 2.3.4 超低温疗法的应用25
• 3 结果与分析25-39
• 3.1 超低温保存脱毒技术体系的建立和优化25-32
• 3.1.1 外植体的建立26-27
• 3.1.2 培养基蔗糖浓度对草莓茎尖超低温保存后成活率的影响27
• 3.1.3 暗培养时间对草莓茎尖超低温保存后成活率的影响27-28
• 3.1.4 预处理对草莓茎尖超低温保存后成活率的影响28-29
• 3.1.5 化冻时间对草莓茎尖超低温保存后成活率的影响29
• 3.1.6 茎尖长度对草莓茎尖超低温保存后成活率的影响29-30
• 3.1.7 超低温保存正交试验结果30-31
• 3.1.8 茎尖恢复培养与植株再生31-32
• 3.2 草莓病毒检测32-39
• 3.2.1 引物筛选结果32
• 3.2.2 单一RT-PCR检测结果32-33
• 3.2.3 单一RT-PCR检测结果33-34
• 3.2.4 多重RT-PCR检测体系的建立34-37
• 3.2.5 再生苗病毒检测结果37-39
• 3.3 脱毒苗移栽定植39
• 4 结果讨论39-42
• 4.1 超低温疗法脱毒技术体系的优化39-40
• 4.2 无病毒苗恢复培养基的选择40
• 4.3 多重RT-PCR病毒检测体系的优化40-41
• 4.4 脱毒效果检测41-42
• 4.5 再生苗遗传稳定性分析42
• 5 小结42-43
• 6 展望43-44
• 参考文献44-50
• 攻读学位期间发表的学术论文及研究成果50-51
• 致谢51

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