荔枝结合态过氧化物酶分离纯化及其性质的初步研究

发布时间：2017-03-22 10:07

  本文关键词：荔枝结合态过氧化物酶分离纯化及其性质的初步研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：褐变导致荔枝采后品质劣变很快,过氧化物酶(POD)是参与荔枝采后褐变的关键酶之一。前人已研究了采后褐变过程中可溶性过氧化物酶(SPOD)活性的变化。本试验以成熟‘乌叶’荔枝为材料,首次测定了荔枝采后结合态过氧化物酶(BPOD)活性变化；探索了荔枝果皮BPOD的分离纯化体系；应用建立的体系,对荔枝果皮BPOD进行了初步分离纯化;并对分离纯化得到的BPOD第一组分进行酶学性质的初步研究。主要的结果如下：对与荔枝褐变相关的生理指标进行测定,4℃与25℃贮藏期间,随着贮藏时间的延长,果皮的褐变指数上升,但果肉可溶性固形物含量(TSS)几乎没有变化,均为16%左右。4℃贮藏,可溶性POD,结合态POD活性均是先上升后下降,同工酶谱条带强弱变化与活性变化一致,但并未出现新的条带也无原条带的消失。25℃贮藏条件下,伴随果实的褐变进程,结合态POD活性迅速上升；同工酶电泳结果显示,结合态POD部分组分的活性显著增加。通过对荔枝果皮匀浆,弃滤液(可溶态POD粗酶液),反复悬浮滤渣,再加入含甘油,去垢剂Triton X-100的盐溶液从荔枝果皮中提取出BPOD粗酶液,并摸索了其在不同层析介质上的分离特性,由此建立了荔枝BPOD的分离纯化体系：将BPOD粗酶液过Streamline Phenyl柱进行粗分离,再过阳离子交换柱CM-52,疏水作用层析Phenyl Sepharose HP,凝胶过滤层析Superdex 200,得到BPOD的四个组分。对纯化后的第一组分进行酶学性质的初步研究,其最适pH为6.5,最适温度为40℃。在H202存在下,对各种底物表现出的活性强弱为：愈创木酚4-甲基邻苯二酚肉桂醇绿原酸芥子醇邻苯二酚抗坏血酸没食子酸表儿茶素对苯二酚焦性没食子酸；与间苯二酚、苄醇、松柏醇、4-甲氧基酚均无反应。对H202、愈创木酚、4-甲基邻苯二酚、肉桂醇、芥子醇的米氏常数分别为16.3mM.26.9mM、4.5mM、30.1 mM、23.7 mM。DTT、ASA、L-半甘氨酸、Cu2+抑制其活性,Ca2+不影响其活性,Mn2+激活其活性,0.1mM EDTA对其活性无影响,1mM EDTA抑制其活性,0.01% TritonX-100激活其活性,0.05%TritonX-100轻微抑制其活性。
【关键词】：荔枝果皮 褐变 结合态POD 分离纯化 酶学性质 同工酶谱
【学位授予单位】：福建农林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S667.1
【目录】：

• 缩略词表10-11
• 摘要11-13
• Abstract13-15
• 第一章 引言15-28
• 1 荔枝概况15
• 2 采后荔枝果皮褐变的可能机制15-16
• 2.1 失水与褐变15
• 2.2 花色苷与褐变15
• 2.3 酶促褐变15-16
• 2.4 烯与褐变16
• 2.5 微生物与褐变16
• 2.6 其他原因与褐变16
• 3 结合态POD的生理功能16-17
• 4 结合态POD的提取及分离纯化17-24
• 4.1 去垢剂提取结合态POD的机理与应用17-20
• 4.1.1 去垢剂的特性17-18
• 4.1.2 去垢剂的增溶机理18
• 4.1.3 去垢剂的选择18-19
• 4.1.4 去垢剂在结合态POD提取中的应用19-20
• 4.2 结合态POD的柱层析分离20-23
• 4.2.1 离子交换层析20-21
• 4.2.2 分子筛层析21
• 4.2.3 疏水作用层析21-22
• 4.2.4 亲和层析22
• 4.2.5 柱层析在结合态POD分离纯化中的应用22-23
• 4.3 去垢剂对膜蛋白分析的影响及去除23-24
• 4.4 小结24
• 5 结合态POD的酶学性质24-26
• 5.1 结合态POD的分子量24-25
• 5.2 结合态POD的最适pH25
• 5.3 结合态POD的最适温度及热稳定性25
• 5.4 结合态POD对不同底物的亲和力25-26
• 5.5 抑制剂对结合态POD活性的影响26
• 5.6 金属离子对结合态POD活性的影响26
• 6 本研究的目的及内容26-28
• 6.1 本研究目的27
• 6.2 本研究内容27-28
• 第二章 荔枝采后果皮可溶性和结合态POD活性变化28-36
• 1 材料与方法28-30
• 1.1 材料28
• 1.2 仪器与试剂28
• 1.3 果皮褐变指数的评定28
• 1.4 果肉可溶性固形物的测定28-29
• 1.5 果皮可溶态结合态POD的提取29
• 1.6 POD活性检测29
• 1.7 POD同工酶谱29-30
• 2 结果与分析30-34
• 2.1 果皮褐变指数的变化30-31
• 2.2 果肉可溶性固形物含量的变化31
• 2.3 果皮可溶态结合态POD活性与同工酶谱变化31-34
• 3 小结与讨论34-36
• 第三章 荔枝结合态POD分离纯化体系的探索36-50
• 1 材料与方法36-39
• 1.1 材料36
• 1.2 仪器与试剂36
• 1.3 结合态POD粗酶液提取及富集36-37
• 1.4 Streamline Phenyl柱层析37
• 1.5 CM-52柱层析37-38
• 1.6 CM-Sepharose HP柱层析38
• 1.7 Phenyl Sepharose HP柱层析38
• 1.8 Superdex 200柱层析38
• 1.9 结合态POD活性检测38
• 1.10 结合态POD的Native-PAGE38
• 1.11 结合态POD的SDS-PAGE38-39
• 2 结果与分析39-47
• 2.1 结合态POD粗酶液的富集39-40
• 2.2 Streamline Phenyl柱层析的探索40-42
• 2.2.1 洗脱方式的探索40-42
• 2.2.2 去垢剂的选择42
• 2.3 Streamline Phenyl→CM-52柱层析的探索42-43
• 2.4 Streamline Phenyl→CM-Sepharose HP→Superdex 200柱层析的探索43-46
• 2.5 Phenyl Sepharose HP柱层析的探索46-47
• 3 小结与讨论47-50
• 3.1 结合态POD的提取47
• 3.2 Streamline Phenyl柱层析47-48
• 3.3 CM-52柱层析与CM-Sepharose HP柱层析的比较48
• 3.4 Phenyl Sepharose HP柱层析48
• 3.5 结合态POD的分离纯化顺序48-50
• 第四章 荔枝果皮结合态POD的分离纯化50-56
• 1 材料与方法50-51
• 1.1 材料50
• 1.2 仪器与试剂50
• 1.3 结合态POD的提取50
• 1.4 Streamline Phenyl柱层析50
• 1.5 CM-52柱层析50-51
• 1.6 Phenyl Sepharose HP柱层析51
• 1.7 Superdex 200柱层析51
• 1.8 结合态POD活性检测51
• 1.9 结合态POD的Native-PAGE51
• 2 结果与分析51-55
• 2.1 Streamline Phenyl柱层析51
• 2.2 CM-52柱层析51-53
• 2.3 Phenyl Sepharose柱层析53-54
• 2.4 Superdex 200柱层析54-55
• 3 小结与讨论55-56
• 第五章 结合态POD酶学性质56-65
• 1 材料与方法56-58
• 1.1 材料56
• 1.2 仪器与试剂56
• 1.3 pH对结合态POD活性影响的测定56
• 1.4 温度对结合态POD活性影响的测定56
• 1.5 结合态POD对底物特异性的测定56-57
• 1.6 结合态POD对底物Km值的测定57-58
• 1.7 抑制剂及金属离子对结合态POD活性影响的测定58
• 2 结果与分析58-62
• 2.1 pH对结合态POD活性的影响58
• 2.2 温度对结合态POD活性的影响58-59
• 2.3 结合态POD对底物的特异性59-60
• 2.4 结合态POD对底物的Km值60-61
• 2.5 抑制剂及金属离子对结合态POD活性的影响61-62
• 3 小结与讨论62-65
• 第六章 总结与展望65-67
• 1 总结65
• 2 展望65-67
• 参考文献67-75

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  本文关键词：荔枝结合态过氧化物酶分离纯化及其性质的初步研究，，由笔耕文化传播整理发布。

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