西瓜嗜酸菌致病相关基因的筛选及功能分析

发布时间：2017-03-25 05:11

  本文关键词：西瓜嗜酸菌致病相关基因的筛选及功能分析，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：瓜类细菌性果斑病(bacterial fruit blotch,简称BFB),主要危害西瓜、甜瓜,引起叶斑或叶枯,造成果实腐烂,导致大量减产,严重时甚至绝收；其病原为西瓜嗜酸菌(Acidovorax citrulli),被国际规定为检疫性有害生物之一。然而,目前对此病菌致病机制的探究相对来说较少,因此本研究的主要目标是找出以及克隆致病相关基因,并对其功能进行分析。从本实验室构建的西瓜嗜酸菌突变体文库中活化出1468株突变体作为出发菌,经过两轮的西瓜果实致病性测定,获得了215株致病性丧失或明显下降的突变体；对1468株突变体进行观察,发现131株突变体颜色发生了变化,160株突变体形态发生改变。在西瓜果实上致病性丧失的127株突变体中,83.5%的突变体颜色发生改变,85.8%的突变体形态发生了变化,然而致病性显著下降的88株突变体与其颜色和形态没有明显的相关性。对致病力丧失或显著减弱以及颜色和(或)形态有变化的50株突变体进行甜瓜浸种试验,从中挑出16株致病力丧失或减弱的突变体进行西瓜摩擦接种试验,筛选出11株突变体进行亚克隆,得到了9个相关基因。利用三亲杂交的方法,构建其中5个突变体的互补菌株,这些突变体被插入的基因分别为：1transcriptional regulator AraC family, HrpB; hypothetical protein; DNA-3-methyladenine glycosylase I; L-threonine aldolase; pilus retraction ATPase. PilT。将野生菌A13和3号,5株突变体(195、462、944、X484、X522)以及5株互补菌株(195hb、462hb、944hb、X484hb、X522hb)的过敏性反应、致病性、形态特征、颜色显示、生长能力、群体感应信号、生物膜等进行研究,结果发现互补菌株195hb基本恢复了过敏反应、致病能力以及生物膜形成能力；菌株944hb恢复了游动能力；菌株X522hb部分恢复了致病能力；其余互补菌株(462hb、 944hb、X484hb)致病性等表型均没有恢复,因此表明了HrpB和PUT基因是与西瓜嗜酸菌致病相关的基因。
【关键词】：西瓜嗜酸菌 致病性 亚克隆 三亲杂交 生物学特性
【学位授予单位】：福建农林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S436.5
【目录】：

• 摘要8-9
• Abstract9-11
• 1 前言11-19
• 1.1 BFB的研究简况11-15
• 1.1.1 病原菌分类及形态特征11-12
• 1.1.2 寄主范围与发病规律12-13
• 1.1.3 危害13-14
• 1.1.4 症状特点14
• 1.1.5 防治策略14-15
• 1.2 西瓜嗜酸菌致病机理的研究进展15-18
• 1.2.1 Ⅱ型和Ⅲ型分泌系统16
• 1.2.2 群体感应系统16-17
• 1.2.3 鞭毛17
• 1.2.4 菌毛17-18
• 1.3 本研究的目的意义18-19
• 2 西瓜嗜酸菌致病性缺失突变体的筛选及Tn5插入位点的鉴定19-36
• 2.1 实验材料19-20
• 2.1.1 菌株、质粒19
• 2.1.2 植物19
• 2.1.3 培养基与试剂19
• 2.1.4 引物19-20
• 2.1.5 主要仪器20
• 2.2 方法20-27
• 2.2.1 菌株的培养20
• 2.2.2 西瓜果实致病性测定20-21
• 2.2.3 突变菌株菌落形态与颜色观察21
• 2.2.4 甜瓜浸种接种21-22
• 2.2.5 西瓜苗摩擦接种22
• 2.2.6 突变菌株的PCR检测22-23
• 2.2.6.1 总DNA的提取22-23
• 2.2.6.2 菌株的PCR扩增23
• 2.2.6.3 电泳检测23
• 2.2.7 突变体转座子插入位点的鉴定---亚克隆技术23-27
• 2.2.7.1 突变体总DNA及pBlue质粒DNA的提取23-24
• 2.2.7.2 突变体基因组与质粒DNA单酶切24-25
• 2.2.7.3 基因组DNA和pBLue载体酶切产物的回收与连接25-26
• 2.2.7.4 转化26-27
• 2.2.7.4.1 大肠杆菌DH5α热激感受态细胞的准备26-27
• 2.2.7.4.2 热激转化27
• 2.2.7.5 转化子的筛选27
• 2.2.7.6 序列分析27
• 2.3 结果与分析27-35
• 2.3.1 西瓜果实上突变体致病力筛选结果27-28
• 2.3.2 突变菌株菌落形态和颜色的观察28-29
• 2.3.3 甜瓜种子接种29-31
• 2.3.4 西瓜苗摩擦接种31-32
• 2.3.5 待测突变菌株的PCR检测32
• 2.3.6 突变体Tn5转座子插入位点的鉴定32-35
• 2.3.6.1 突变菌株总DNA和质粒DNA Pst Ⅰ酶切效果32-33
• 2.3.6.2 转化子的获得33-34
• 2.3.6.3 序列分析34-35
• 2.4 小结与讨论35-36
• 3 西瓜嗜酸菌5个插入基因的功能鉴定36-56
• 3.1 实验材料36-39
• 3.1.1 菌株、质粒36-37
• 3.1.2 引物37-38
• 3.1.3 植物38
• 3.1.4 培养基38-39
• 3.1.5 主要试剂39
• 3.1.6 主要仪器39
• 3.2 实验方法39-43
• 3.2.1 菌株的培养39
• 3.2.2 互补菌株的构建39-41
• 3.2.2.1 野生菌总DNA的提取39
• 3.2.2.2 PCR扩增目的基因39
• 3.2.2.3 重组质粒的获得39-40
• 3.2.2.4 互补质粒的构建40
• 3.2.2.5 转化-三亲杂交的方法40-41
• 3.2.2.6 克隆子验证41
• 3.2.3 过敏性反应测定41
• 3.2.4 西瓜果实致病性测定41
• 3.2.5 甜瓜苗的致病性测定41
• 3.2.6 西瓜苗的致病性测定41
• 3.2.7 菌株菌落生长状况41-42
• 3.2.8 生长曲线的测定42
• 3.2.9 生物膜的测定42
• 3.2.10 游动性的测定42
• 3.2.11 群体感应测定42
• 3.2.12 电镜观察42-43
• 3.3 结果与分析43-54
• 3.3.1 互补菌株的构建43-47
• 3.3.1.1 PCR扩增43
• 3.3.1.2 重组质粒的获得43-44
• 3.3.1.3 测序分析44-46
• 3.3.1.4 互补菌株的获得46-47
• 3.3.2 烟草过敏反应47
• 3.3.3 西瓜果实致病性测定47
• 3.3.4 甜瓜浸种47-49
• 3.3.5 西瓜苗喷雾接种49-50
• 3.3.6 菌株菌落生长状况50
• 3.3.7 生长曲线测定50-52
• 3.3.8 生物膜测定52-53
• 3.3.9 游动性测定53
• 3.3.10 群体感应测定53-54
• 3.3.11 电镜观察54
• 3.4 小结与讨论54-56
• 4 结论与讨论56-57
• 4.1 主要结论56
• 4.2 讨论56-57
• 参考文献57-62
• 附录62-66
• 致谢66

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