微波、亚硝基胍对枝孢样枝孢霉生长特性和致病性影响的研究

发布时间：2020-07-30 03:10

【摘要】：目的：枝孢样枝孢霉是一种广泛存在于环境中的暗色真菌,伴随着人类免疫抑制病增多,枝孢样枝孢霉感染人和动物的病例都有所增加,也是真菌过敏症的重要病原菌之一。目前,对枝孢样枝孢霉致病机理研究较少,对枝孢样枝孢霉引起的暗色丝孢霉病的诊治效果较差。本研究将利用微波、NTG复合诱变选育枝孢样枝孢霉弱毒突变株,利用SSH进一步筛选野生型和突变型的差异表达基因,以探究枝孢样枝孢霉的分子致病机制,为其引起的大熊猫及人皮肤病的诊断、治疗提供依据,为枝孢样枝孢霉的后续研究提供参考。方法：本试验采用大熊猫源枝孢样枝孢霉为出发菌株,用不同浓度的NTG和微波诱变,获得表型和致病力都发生明显变化的突变株,进而采用抑制性消减杂交技术构建大熊猫源枝孢样枝孢霉差异表达基因的消减cDNA文库,获得其差异表达基因片段,进行序列测定以及生物信息学分析。结果：1.确定了枝孢样枝孢霉最佳的复合诱变条件为微波60s+2mg/mL NTG 30min;通过诱变筛选得到一株菌落颜色明显变浅、产孢量少,产孢速度慢、易衰老的菌株(Zt)；对野生型和突变型菌株进行小鼠致病性试验和感染率测定,结果表明野生株(Z20)与突变株(Zt)对小鼠皮肤都有侵染机会,野生株对小鼠感染率高达97.5%,突变株对小鼠感染率为42.5%。2.提取上述枝孢样枝孢霉野生型和突变型的总RNA,并分离出其mRNA,利用SSH建立了野生型与突变型的差异表达cDNA文库。经过筛选、序列测定获得野生型特异片段5个,突变型特异片段2个。3.将上述序列在Genebank进行BLAST同源比对,比对结果如下：a.生化代谢类：FH1-3与细胞色素氧化酶亚单位Ⅰ高度同源,与线粒体基因高度同源,FH1-4和FH1-5与假设蛋白有一定同源,与线粒体基因高度同源。b.细胞结构类：FH1-1与金属羧肽酶抑制剂、细胞壁水解酶、脂蛋白有一定同源,FH2-1与脂肪酶有一定同源性；c.其他类：FH1-2与第一类整合子DfrA17基因有一定同源,与白喉毒素抑制因子基因有一定同源性,与细胞毒素蛋白也有一定同源性。将7条序列在ORF finder、 Predictprotein和Omiga2.0进行分析,所得序列都含有可能的ORF,以及不同数量、不同位点的真菌基序,提示这些差异序列都是枝孢样枝孢霉菌株内编码蛋白质的基因片段。结论：确定了致枝孢样枝孢霉突变的诱变条件,获得了其表型改变、致病力减弱的突变株(Zt)。利用抑制消减杂交技术成功建立了枝孢样枝孢霉野生型和突变型的差异cDNA文库,筛选出野生型和突变型差异表达基因片段,分别与细胞结构、生化代谢及毒素相关蛋白同源,说明这些片段可能为枝孢样枝孢霉野生型和突变型相关分化、代谢、毒素蛋白的部分片段,并可能包含与枝孢样枝孢霉有关的毒力因子,为研究枝孢样枝孢霉分子致病机制提供了重要信息。
【学位授予单位】：四川农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S852.66

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