基于致病性丧失突变体Focr4-1366的香蕉枯萎病菌致病相关基因功能分析

发布时间：2020-07-31 12:06

【摘要】：香蕉枯萎病(banana vasicular wilt)国外称巴拿马病,是由尖镰孢古巴专化型(Fusarium oxysporum f.sp.cubense,Foc)引起的极具破坏力的一种土传真菌病害。Foc种下分为4个小种,4号小种不仅寄主范围广且破坏力强,对香蕉产业造成了巨大的危害。到目前为止,国内外科学家在香蕉枯萎病病理学上做了许多卓有成效的研究,完成了Foc1号和4号小种的全基因组测序,克隆了一些致病相关基因,但其致病分子机制仍不十分清楚。 本实验室前期合作完成了Foc1号和4号小种的全基因组测序,并且通过T-DNA插入建立Focr4突变体库。通过致病性测定筛选获得了一批致病性丧失或减弱突变体,对一批致病性丧失或严重减弱突变体插入失活基因进行了拷贝数验证、插入位点定位和基因cDNA序列克隆。本研究在此工作基础上,以其中Foc4号小种致病性丧失突变体Focr4-1366为研究对象,开展了Foc致病性离体叶片快速测定条件优化、Foc4号小种强致病性野生型菌株分离鉴定；通过反转录PCR方法验证该插入失活基因在野生型菌株中的表达,该基因的敲除载体和互补载体构建,从强致病力野生型菌株中对该基因进行敲除和互补验证该基因的致病相关性,对获得的敲除子△Focr4B-1366与互补子△Focr4B-1366-cp进行致病相关生物学表型观察。取得了如下5个方面的研究结果： (1)对Foc致病性离体叶片测定的温度条件进行了优化,避免了离体叶片测定结果因环境条件变化而变化的缺陷,提高了Foc致病性测定结果的稳定性和可靠性。 (2)分离获得了1株致病性强的Foc4号小种野生型菌株Focr4B。 (3)成功构建Focr4-1366插入失活基因的敲除载体和互补载体,对野生型菌株Focr4B进行基因敲除和互补。敲除子丧失了致病性,互补子恢复了致病性,从而验证了该基因为致病相关基因。 (4)通过对T-DNA插入突变体Focr4-1366、敲除子△Focr4B-1366、互补子△Focr4B-1366-cp及野生型菌株Focr4B进行生物学表型观察。结果发现,T-DNA插入突变体Focr4-1366口敲除子△Focr4-1366产孢能力和碳源利用能力较野生型Focr4-B与互补子△Focr4B-1366-cp低,而在菌丝形态和孢子形态、最适温度、最适合生长PH值上没差别；除互补子△Focr4-1366-cp的孢子萌发率稍低外,Focr4-B与Focr4-1366、△Focr4-1366孢子萌发率没有差别。初步推测插入失活基因影响产孢量和碳源的利用,而对孢子萌发及菌丝、孢子形态没有显著的影响。 (5)通过敲除子△Focr4B-1366,野生型菌株Focr4B产生的粗毒素对香蕉苗的影响及它们对细胞壁降解酶敏感性进行测定。实验结果表明：侵泡在从野生型菌株分泌的发酵液中,香蕉叶片黄化程度远比敲除突变体的严重。说明该致病相关基因与毒素的分泌相关,该基因敲除后影响了Focr4B的毒素产生能力；在相同的酶解时间,突变体、野生型、互补子释放的原生质体量没明显差别,该基因不影响对细胞壁降解酶的敏感性。
【学位授予单位】：海南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S436.68

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本文编号：2776453