玉米ZmPOT基因TALEN敲除和过表达载体的构建及遗传转化

发布时间：2020-08-10 17:47

【摘要】：容重是一个重要的产量性状,也是作物超高产育种的重要目标性状。玉米容重能够真实地反映玉米的成熟度、完整度、均匀度、籽粒结构紧实度和使用价值,是玉米商品及加工品质的重要指标,是国际贸易中质量定级的重要因素。长期以来,对玉米品质的研究大多集中在如何提高营养价值和加工品质上,而忽略了商品品质尤其是容重对玉米品质的影响。对容重这个复杂性状的遗传基础研究不够深入,导致我国玉米容重改良进展缓慢,严重影响了国际市场的竞争力。课题组前期以容重为研究对象,在玉米第7号染色体上定位到一个主效的QTL,该QTL区段内存在一个重要的候选基因,命名为ZmPOT。功能预测表明该基因编码POT家族蛋白,是氨基酸进入细胞内的关键膜转运蛋白。本研究构建了带有胚乳特异性启动子GT1的植物过表达载体pCUB-GT1-ZmPOT-bar以及TALEN敲除ZmPOT基因的载体。通过农杆菌介导法进行玉米幼胚和胚性愈伤组织的遗传转化,以期建立玉米TALEN敲除体系,并利用过表达及敲除技术研究ZmPOT基因的功能。本研究取得如下结果：1.以B73籽粒总RNA反转录的cDNA为模板,克隆了ZmPOT基因。所克隆的ZmPOT序列全长为2084 bp,编码640个氨基酸,扩增的片段与Gramene数据库公布的该基因序列相似性为100%。2.用In-Fusion法将胚乳特异性启动子Gt1和目的基因分别连接到pCUB骨架载体上,构建了植物表达载体pCUB-GT1-ZmPOT-bar.经PCR检测、酶切鉴定及表达载体的序列分析表明,表达载体构建成功。3.为了保证TALEN敲除的特异性,我们在玉米ZmPOT基因的第二个外显子上设计了TALEN左右臂靶点。利用质粒文库试剂盒,将TALEN质粒模块分别构建到左右臂骨架载体上。4.分别酶切左右臂骨架载体和p CAMBIA1301植物表达载体,再将TALEN左右臂模块连接到pCAMBIA1301植物表达载体上,经过酶切鉴定及模块序列分析表明,表达载体构建成功。5.通过农杆菌介导法将pCUB-GT1-ZmPOT-bar和TALEN敲除载体分别转化玉米幼胚组织和玉米胚性愈伤组织。经除草剂草甘膦和潮霉素筛选后得到具有抗性的转基因植株,以幼胚为受体得到过表达载体的To代抗性植株9株,以愈伤组织为受体得到的TALEN敲除载体To代抗性植株146株。6.根据启动子区设计特异引物,经PCR检测过表达载体抗性植株基因组DNA,未得到阳性植株。TALEN敲除载体得到阳性植株15株。7将TALEN敲除载体得到的15株To代阳性植株播种到云南,共330株T1代植株,PCR检测有43株为阳性。T7EI酶切鉴定打靶效率,检测结果表明未发现目标基因区域有打靶发生。8.运用qRT-PCR技术,检测阳性植株叶片中FokI基因的表达量,检测结果表明部分转基因材料中FokI基因有高表达。9.对T1代阳性转基因后代进行表型测定,结果表明：阳性转基因植株玉米的粒长和粒宽与对照相比明显变小。
【学位授予单位】：四川农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S513;Q943.2

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本文编号：2788422