产脂肽类菌株QHZ-3对马铃薯黑痣病的生防效果及其机理研究

发布时间：2020-10-28 01:24

　　 由立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)侵染引起的马铃薯黑痣病是一种真菌性病害,严重影响马铃薯块茎的产量、外观品质和商品性,以及种薯企业的种植效益,探索这一病害安全有效的生物防治方法迫在眉睫。本研究通过比较已筛选出的5株生防芽孢杆菌(QHZ-1、QHZ-2、QHZ-3、QHZ-4、QHZ-5)分泌促生物质的能力以及脂肽类抗生素合成酶基因的检测,选择生防潜力最好的菌株,研究其生防效果及其作用机理,并优化其发酵条件后制成生物有机肥,通过盆栽试验验证其生防效果。主要研究结果如下:1.供试生防菌可产生大量的促生物质,菌株QHZ-3的产量显著高于其它菌株(1)5株生防菌均可分泌铁载体,其中以菌株QHZ-3的分泌量显著高于其它菌株。定量分析结果显示,QHZ-3在发酵液中铁载体的表达量可达40.59%,比分泌量最小的QHZ-1增加了14.58%;(2)5株生防菌均有一定的解磷能力,对Ca_3(PO_4)_2的溶解能力以QHZ-2、QHZ-3和QHZ-4较强,发酵液中有效磷的浓度分别为9.89μg/mL、10.53μg/mL和10.19μg/mL,QHZ-1的解磷能力最差,仅为5.16μg/mL;(3)5株生防菌也可产生大量吲哚乙酸(IAA),其中以菌株QHZ-3和QHZ-5的产量最高,分别为17.20mg/mL和16.18 mg/mL,QHZ-2的产量最低,仅为QHZ-3的51%。2.采用分子生物学方法检测了5株菌的抗生素合成基因,发现QHZ-1和QHZ-2具有丰原素(Fengycin)和伊枯草菌素(Iturin)合成酶基因;QHZ-4仅具有Fengycin合成酶基因;而QHZ-3与QHZ-5菌株同时具有表面活性素Surfactin、Iturin和Fengycin三种脂肽类抗生素合成酶基因。综合比较5株生防菌潜在的促生与拮抗能力,选择最具生防潜力的QHZ-3进一步优化发酵条件、生物有机肥的研制以及生防效果试验。3.利用LC-MS技术对菌株QHZ-3产生的脂肽类抗生素种类进行定性,发现QHZ-3可以分泌Surfactin、Iturin和Fengycin三种脂肽类抗生素。所以,QHZ-3是产脂肽类抗生素菌株。4.菌株QHZ-3的液体及固体发酵条件优化(1)单因素试验结果表明,QHZ-3液态发酵最佳条件为:装液量60/250mL三角瓶、接种量6%、摇床转速180 r/min、发酵时间60h;(2)正交试验结果显示:装液量40/250 mL三角瓶、摇床转速170 r/min、接种量6%、发酵时间48h的组合下,QHZ-3的生长状态最佳,活菌数可达到1.31×10~(10)cfu·mL~(-1);(3)将QHZ-3接种在腐熟的牛粪有机肥中,采用优化的接种量10%制成QHZ-3产脂肽类生物有机肥,活菌数可达到1.02×10~9 cfu·mL~(-1)。5.盆栽试验设置3个处理:对照(CK)、QHZ-3菌悬液(QHZ-3)与QHZ-3产脂肽类菌株制成的生物有机肥(BOF)。在马铃薯块茎形成期测定了不同处理中植株地上部和根系的生长情况,以及土壤中病原菌立枯丝核菌的数量,试验结果表明:(1)QHZ-3和BOF处理中马铃薯植株的株高、茎粗及生物量等均高于CK。BOF处理的效果显著优于QHZ-3,尤其是对马铃薯地下部的生长影响最为显著,地下部干重比QHZ-3处理增加了1.81倍;(2)QHZ-3和BOF处理也改善了马铃薯植株叶片的形态,增加了叶片厚度,并提高了叶片的叶绿素含量(SPAD值)与光合有效辐射,尤其是BOF处理的SPAD值较CK提高了40.3%,较QHZ-3提高了15.91%;(3)BOF显著改变了马铃薯的根系形态:根表面积、根尖数与根体积等根系参数均显著高于QHZ-3和CK,尤其是BOF的根尖数分别达到了CK和QHZ-3处理的4.11与1.82倍,为马铃薯根系的吸收创造了条件;(4)BOF处理显著降低了马铃薯根际土壤中黑痣病病原菌立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)的绝对量。在种植后第60d的定量结果显示,BOF处理的马铃薯根际土壤中立枯丝核菌的绝对量降至1.34×10~5 copies/g,比CK(1.02×10~6copies/g)降低了一个数量级。综上所述,QHZ-3不仅具有显著的促生作用,而且通过活化土壤养分促进了根系的吸收和生长;QHZ-3通过产生多种脂肽类抗生素抑制了病原菌立枯丝核菌的生长,是一株产脂肽类抗生素菌株的高效生防菌株;以此菌株制成的生物有机肥其作用效果优于菌悬液处理,说明生防菌的二次固体发酵显著增强了其促生和拮抗能力。
【学位单位】：甘肃农业大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2020
【中图分类】：S435.32;S476.1
【部分图文】：

产脂肽类菌株QHZ-3对马铃薯黑痣病的生防效果及其机理研究21的拮抗机制提供保障，我们对5株菌中抗菌物质合成基因的表达进行了测定，结果如下。注：M，DNA标记DL2000；泳道1-5分别为菌株QHZ-1、QHZ-2、QHZ-3、QHZ-4、QHZ-5，CK模板为ddH2O图2-45株生防菌fenB功能基因的检测分析结果Fig.2-4DetectionoffunctionalgenesoffenBfrom5strainsofbiocontrolbacteria如图2-4所示，所有菌株均扩增出与目的片段（535bp）相同大小的条带。结合测序结果，我们可以确定所有菌株均具fengycin合成酶编码基因。且5株生防菌中的fenB基因与Bacillussubtilisfengycin合成酶基（L42523.1）同源性分为98%、95.28%、95.34%、95.22%、95.22%。针对抗菌物质Iturin，选择其调控基因itua基因（616bp）作为合成酶的代表基因进行扩增。检测结果如图2-5所示。注：M，DNA标记DL2000；泳道1-5分别为菌株QHZ-1、QHZ-2、QHZ-3、QHZ-4、QHZ-5，CK模板为ddH2O图2-5五株生防菌ituA功能基因的检测分析结果Fig.2-5DetectionoffunctionalgenesofituAfrom5strainsofbiocontrolbacteriaQHZ-1、QHZ-2、QHZ-3、QHZ-5菌株扩增得到目的片段大小的明亮条带，QHZ-1、QHZ-2菌株中的ituA基因序列分别与B.atrophaeusUCMB-5137菌株的ituA基因（CP011802.1）同源性达到99%和97%，QHZ-3、QHZ-5与B.atrophaeusGQJK17菌株的ituA基因（CP022653.1）同源性达到99%。结合测序结果我们得知，QHZ-1、QHZ-2、QHZ-3、QHZ-5具iturin合成酶编码基因。200015001000750500250100M12345CKM12345CK200015001000750500250100200015001000750500250100

甘肃农业大学2020届硕士学位论文22注：M，DNA标记DL2000；泳道1-5分别为菌株QHZ-1、QHZ-2、QHZ-3、QHZ-4、QHZ-5，CK模板为ddH2O图2-65株生防菌srfAA功能基因的检测分析结果Fig.2-6DetectionoffunctionalgenesofsrfAAfrom5strainsofbiocontrolbacteria从图2-6可知，5株生防菌中，QHZ-3与QHZ-5扩增出与目的基因（221bp）一致的明亮条带，测序结果与BacillussubtilisSurfactin合成酶基（KC454625.1）同源性分别为97%、98%。因此，QHZ-3与QHZ-5具备Surfactin合成酶基因。上述结果表明，5株生防菌中可检测到表面活性素srfAA、伊枯草菌素IturinA、丰原素Fengycin等合成酶基因，因此，5株生防菌株可能通过产生脂肽抗生素抑制病原菌的生长。3.3优良生防菌QHZ-3对立枯丝核菌的抑菌效果测定通过上述试验我们发现，在5株生防菌中，QHZ-3产生各种促生物质的能力均最强，且该菌株存在抑制植物病原菌的3种脂肽类抗生素合成相关基因，推测该菌株可能同时具有抑制细菌性与真菌性病原菌活性的作用，是一株理想的生防菌株，为此，以下试验采用QHZ-3菌株为试验对象。图2-7菌株QHZ-3对马铃薯黑痣病病原菌的抑制效果M12345CK200015001000750500250100CK

甘肃农业大学2020届硕士学位论文26图2-11QHZ-3菌株3种脂肽类物质LC-MS检测图Fig.2-11LC-MSforthelipopeptidesantibioticsisolatedfromQHZ-3表2-4QHZ-菌株粗提液中脂肽类抗生素surfactin、iturins以及fengycins分子量测定Table2-4Calculatedmassvaluesofiturins，fengycinsandsurfactinsinculturelipopeptidesextractsfromQHZ-3脂肽类抗生素分子量MM+H*表面活性素SurfactinSurfactinA（C13）1007.61008.7*SurfactinB（C14）1021.71022.8*SurfactinC（C15）1035.71036.7*伊枯草菌素（Iturins）BacillomycinL（C13）1020.51021.5*丰原素FengycinA（C15/Ala-6）1448.81449.7*FengycinsFengycinC（C17/Ala-6）1476.81477.8*“*”：在QHZ-3脂肽类抗生素质谱结果中检测到相应的质子化峰值ThelipopeptidesincorrespondingpeakoflipopeptidesantibioticfromQHZ-3wasdetectedinspectrum
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本文编号：2859356