副猪嗜血杆菌脂多糖刺激猪肺泡巨噬细胞引起NLRP3的变化及其对NF-κB信号通路的影响

发布时间：2020-10-28 07:25

　　 副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,HPS)是一种革兰氏阴性菌,在猪的上呼吸道中广泛存在,属于条件致病菌,是引起猪格拉瑟氏病的病原,患病猪以纤维素性浆膜炎、脑膜炎和多发性关节炎为主要特征,主要影响5-8周龄的保育猪,给养猪业造成严重的经济损失。猪肺泡巨噬细胞(Porcine alveolar mcrophage cell,PAM)在肺的天然免疫中起到重要作用,是抵御外来病原微生物侵袭肺脏的第一道防线。PAM可以吞噬、杀灭病原,释放细胞因子和趋化因子等免疫因子到感染部位发挥免疫功能,来调控肺部的炎症反应。本研究通过热酚水法提取副猪嗜血杆菌的脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS),分别采用硫酸-苯酚法、紫外分光光度法测定LPS提取物中多糖及核酸含量,再通过SDSPAGE电泳银染方法进一步鉴定提取物。将提取的LPS作用于猪肺泡巨噬细胞,探讨N LRP3抑制剂对副猪嗜血杆菌LPS刺激猪肺泡巨噬细胞中IL-1β表达量的影响,研究LP S激活TLR4受体进而诱导NF-κB信号通路的变化规律。研究结果如下:1.副猪嗜血杆菌脂多糖的提取、纯化和鉴定采用热酚水法提取副猪嗜血杆菌血清5型LZ株的LPS,并采用酶解法和超离法纯化副猪嗜血杆菌的LPS提取物,从2.46g HPS菌体沉淀中提取纯化得到LPS 60mg,平均产率为2.44%。用硫酸-苯酚法测定结果显示,所制备的LPS提取物中不含有还原性单糖,多糖浓度为176μg/mL;微量紫外分光光度计测定结果显示,所制备的LPS提取物中核酸含量为430.1μg/mL;银染鉴定结果显示,提取、纯化的副猪嗜血杆菌LPS提取物条带分布在35 kDa~160 kDa之间。2.NLRP3抑制剂对副猪嗜血杆菌LPS刺激PAM细胞IL-1β表达量的影响经副猪嗜血杆菌LZ株LPS处理后的细胞,NLRP3炎性复合体明显被激活,而经过MCC950抑制剂处理的细胞NLRP3炎性复合体的活化明显被抑制,同时也抑制了IL-1β的表达。3.LPS激活TLR4进而诱导NF-κB信号通路的变化规律脂多糖(LPS)刺激后,与对照组PAM相比较,加入TLR4 siRNA的PAM细胞质中IκB和P65浓度升高,而p-IκB和p-p65浓度降低,细胞核中p-p65浓度降低。结果表明,通过TLR4被激活后,副猪嗜血杆菌LPS刺激PAM激活TLR4诱导NF-κB通路,将IκB和部分NF-κB磷酸化,部分游离的NF-κB迅速移位到细胞核中,细胞受到刺激后IκB激酶复合体活化,诱导相关基因表达。综上,副猪嗜血杆菌脂多糖刺激、诱导猪肺泡巨噬细胞中IL-1β的分泌和NLRP3炎性复合体的活化,并能激活TLR4蛋白从而引起IκB激酶复合体活化,导致IκB和NFp65磷酸化。该研究揭示了脂多糖在猪副嗜血杆菌感染中的作用,为副猪嗜血杆菌的防治提供了研究数据,具有重要意义。
【学位单位】：山东农业大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2020
【中图分类】：S858.28
【文章目录】：
中文摘要
Abstract
1 前言
    1.1 副猪嗜血杆菌的概述
    1.2 副猪嗜血杆菌的病原型态及培养特性
    1.3 副猪嗜血杆菌的血清学研究进展
        1.3.1 血清学分型
        1.3.2 分子生物学分型
    1.4 副猪嗜血杆菌致病机制
        1.4.1 副猪嗜血杆菌的毒力因子
        1.4.2 副猪嗜血杆菌逃避肺部的天然免疫
    1.5 副猪嗜血杆菌的临床症状及病理变化
    1.6 副猪嗜血杆菌诊断
    1.7 副猪嗜血杆菌的防控
2 材料与方法
    2.1 材料
        2.1.1 菌株
        2.1.2 主要试剂
        2.1.3 试验相关设备仪器
    2.2 试验方法
        2.2.1 副猪嗜血杆菌脂多糖的提取、鉴定和保存
        2.2.2 NLRP3 抑制剂对副猪嗜血杆菌脂多糖刺激PAM细胞IL-1β表达量的影响
        2.2.3 TLR4 对副猪嗜血杆菌脂多糖刺激PAM细胞NF-κB信号通路的影响
3 结果与分析
    3.1 副猪嗜血杆菌脂多糖的提取、鉴定和保存
        3.1.1 副猪嗜血杆菌脂多糖的纯化结果
        3.1.2 副猪嗜血杆菌脂多糖的定性试验结果
        3.1.3 副猪嗜血杆菌脂多糖中多糖含量测定
        3.1.4 副猪嗜血杆菌脂多糖的核酸含量测定
        3.1.5 副猪嗜血杆菌脂多糖的琼脂糖凝胶电泳鉴定结果
        3.1.6 副猪嗜血杆菌脂多糖的银染鉴定结果
    3.2 NLRP3 抑制剂对副猪嗜血杆菌脂多糖刺激PAM细胞IL-1β表达量的影响
        3.2.1 IL-1β、NLRP3 表达量结果与分析
    3.3 TLR4 对副猪嗜血杆菌脂多糖刺激PAM细胞NF-κB信号通路的影响
        3.3.1 细胞质中IκB、p65 表达量结果与分析
        3.3.2 细胞质中p-IκB、p-p65 表达量结果与分析
        3.3.3 细胞核中p-p65 表达量结果与分析
4 讨论
    4.1 副猪嗜血杆菌脂多糖的提取、鉴定和保存
    4.2 NLRP3 抑制剂对副猪嗜血杆菌脂多糖刺激PAM细胞IL-1β表达量的影响
    4.3 TLR4 对副猪嗜血杆菌脂多糖刺激PAM细胞NF-κB信号通路的影响
5 结论
参考文献
致谢
参与课题情况
攻读硕士学位期间发表的学术论著

【参考文献】

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本文编号：2859782