玉米赤霉烯酮及其衍生物单克隆抗体的制备及免疫试纸检测方法的建立

发布时间：2020-10-28 16:10

　　 玉米赤霉烯酮(zearalenone,ZEN)主要是由禾谷镰刀菌产生的一种广泛存在于谷物和粮食作物中的真菌毒素。它的衍生物有多种,常见的有5种。ZEN能对粮食造成污染问题,并对动物具有雌激素作用,给养殖业带来一系列的经济损失。因此,建立一种快速,简便,特异的检测方法十分必要。本研究制备了ZEN人工抗原,对动物进行免疫后通过细胞融合技术筛选出ZEN mAb,建立了ZEN免疫试纸检测方法。为我国食品安全检测和粮食中ZEN的残留检测提供了技术支持。主要研究内容和结论如下:1将ZEN分子进行化学修饰,引入能与载体蛋白偶联的基团(-COOH)合成酯ZEN-CMO,采用混合酸酐法(MA)将半抗原ZEN-CMO与载体蛋白牛血清白蛋白(BSA)偶联,合成抗原ZEN-BSA;通过羧甲基羟胺半盐酸盐与ZEN产生肟化反应对ZEN分子进行修饰,合成酯ZEN-CMO,采用碳二亚胺法(EDC)与载体蛋白鸡血清白蛋白(OVA)偶联合成包被抗原。对人工抗原ZEN-BSA进行理化性质检测,经紫外(UV),红外(IR),蛋白凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定,检测结果显示,人工抗原合成成功;将ZEN-BSA对4周龄雌性Balb/C小鼠进行免疫,制备多克隆抗体(pAb),经ELISA检测免疫小鼠pAb的效价达到1︰2.56×10~5,间接ELISA检测半数抑制浓度IC_(50)值为38.9 ng/mL,与α-ZER,α-ZOL的交叉反应率为100%,与β-ZER的交叉反应率为30%,与ZAN的交叉反应率为20%,与β-ZOL的交叉反应率为10%。与AFB1,ABG1,ABG2,DON,T-2,FB1等其他真菌毒素没有交叉反应。2将合成的人工抗原ZEN-BSA免疫雌性Balb/C小鼠,采用间接ELISA和间接竞争ELISA检测,挑选细胞融合备用小鼠。利用细胞融合技术将3号小鼠的脾细胞与SP2/0细胞在PEG-1500的作用下进行细胞融合,筛选阳性杂交瘤细胞株制备ZEN mAb,并对其免疫特性进行分析。结果显示:细胞融合后,筛选出三株杂交瘤细胞株分别将其命名为1B12,3A5,4G10。其中,3A5株最好,对三株杂交瘤细胞株进行核型鉴定,获得的3株杂交瘤细胞株染色体的数目平均是98.7条。通过体外培养法和体内诱生腹水法制备出的抗体具有较高的效价,经9次传代培养抗体分泌稳定,细胞培养上清效价是1︰128,腹水抗体效价是1︰5.12×10~5,IC_(50)为7.93 ng/mL。可100%识别ZEN,与α-ZER、α-ZOL、β-ZER、β-ZOL、ZAN的交叉反应率分别为100%、100%、22.91%、16.28%、9.42%。3A5株杂交瘤细胞分泌的ZEN mAb的亲和常数为6.79×10~9 L/mol,说明该株杂交瘤细胞株亲和力高。制备出了效价高、敏感性好、特异性强的ZEN mAb,为ZEN免疫试纸检测方法的建立奠定了基础。3利用ZEN单克隆抗体3A5制备了ZEN icELISA试剂盒,通过对试剂盒进行优化后,线性回归方程曲线良好,回归方程为y=-41.014x+111.14,R~2=0.9809,IC_(50)是30.9 ng/mL,检测范围是5.75~165.96 ng/mL。具有良好的准确度及精密度,可室温保存一年及以上。采用柠檬酸三钠还原法以氯金酸为材料制备胶体金,采用Mey氏系列稳定法对抗体进行标记,建立ZEN胶体金免疫试纸的检测方法。经紫外(UV)和透射电镜扫描后,检测结果表明,胶体金的粒径为25±1.0 nm,说明该胶体金制备成功;确定ZEN mAb的最佳标记浓度是4.5μg/mL;成功研制出ZEN免疫胶体金试纸条(ZEN-Strip),ZEN-Strip具有快速(5-10 min)、灵敏(3.91 ng/mL)、特异(只与ZEN反应,与其他生物毒素无CR)、广谱(可同时检测其衍生物α-ZER、β-ZER、α-ZOL、β-ZOL、ZAN)、简便(不需其他仪器与试剂)等优势,具有良好的市场应用价值和发展前景。
【学位单位】：河南科技学院
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2020
【中图分类】：S859.8
【部分图文】：

第二章ZEN的检测技术研究进展133.3细胞传感器细胞传感器因响应迅速和灵敏度高等优势而在食品安全检测具备一定的研究意义，它在生物传感器的研究过程中有着重要的地位，其原理是是将固定或未固定的活细胞与转换原件组合成的生物传感器。微生物检测的实现是在代谢过程中产生电子后，通过信号传递媒介在电极上放电，产生可被检测的信号，实现微生物的检测。JI等[82]建立了由镰刀菌产生的生物毒素ZEN，检测限是3.2ng/mL，具有较好的检测效果。4小结以上理化性质检测方法和免疫学检测方法均可完成ZEN的检测，然而在对ZEN的多种检测方法中，考虑到检测样品的准确性、灵敏性和方便快捷等特点，相较于ZEN当前的污染现状，免疫学检测技术具有极大的优势，是实现ZEN快速检测的主要技术。因此，制备出高质量的ZEN-mAb，建立ZEN免疫试纸的检测是十分必要的，该方法建立的同时也为我国食品安全检测提供重要的技术支持。技术路线如图2-1。图2-1技术路线图Fig.2-1TechnologyRoadmap

玉米赤霉烯酮及其衍生物单克隆抗体的制备及免疫试纸检测方法的建立223.3人工抗原SDS-PAGE鉴定结果如图3-5所示，在相同条件下，BSA较ZEN-BSA的迁移速度快，说明ZEN-BSA比ZEN的分子质量大，证明抗原合成成功。经凝胶成像系统检测，ZEN-BSA分子量为70569.3，BSA分子量为66430。经计算，ZEN-BSA与ZEN偶联比为1︰13。注：1Marker；2BSA;3ZEN-BSANote:1Marker;2BSA;3ZEN-BSA图3-5人工抗原ZEN-BSA的SDS-PAGE鉴定Fig.3-5SDS-PAGEidentificationofartificialantigenZEN-BSA3.4pAb间接竞争ELISA结果小鼠血清抗体的效价如表3-1、表3-2所示，经ELISA检测，5只小鼠的效价均达到1︰6.4×103，其中马血清封闭液检测抗体效价最高达到1︰2.56×105，猪血清封闭液检测抗体效价最高达到1︰1.28×104，猪血清封闭液阴性、空白检测值均高于马血清封闭液，猪血清封闭液本底值较高，由此可见，马血清封闭液的封闭效果更好，故本实验选用马血清作为封闭液。

第五章ZEN免疫检测试纸方法的建立及初步应用43图5-1ZENStrip结构示意图Fig.5-1ZENStripstructurediagram2.8ZEN胶体金免疫试纸的性能测定2.8.1敏感性配制ZEN标准品母液浓度为62.5μg/L，31.25μg/L，15.63μg/L，7.82μg/L，3.91μg/L，1.96μg/L，0.98μg/L，0.49μg/L，0μg/L。用ZEN-Strip进行测定，根据试纸条的检测限，用肉眼观察T线的显色情况，来判断检测结果的敏感性。2.8.2重复性设置ZEN标准品溶液浓度：高浓度（15μg/L）、中浓度（10μg/L）、低浓度（5μg/L）和空白对照（0μg/L）。取4批不同批次的ZEN-Strip，在不同的时间对其浓度进行检测，确定其重复性。2.8.3符合度从不同的途径收集玉米，饲料和小麦样品各15份。用ZEN-Strip和HPLC-MS/MS检测其符合率。样品前处理操作步骤同第四章。2.8.4保存期ZEN-Strip在4℃条件下保存，定期（30d）检验ZEN-Strip在空白反应液中的显色情况，检测结果与第一次检测时的显色情况相比较，如果显色结果变浅，则该试纸条失效。此为ZEN-Strip有效期。
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本文编号：2860313