OsHV-1感染两种太平洋牡蛎及诱导宿主免疫应答分析

发布时间：2020-11-03 07:50

　　 太平洋牡蛎是我国重要的牡蛎养殖种类,近几年在山东省迅猛发展,在威海、烟台、青岛、滨州等地均形成规模化养殖。随着养殖规模的扩大,贝类病害时有发生。牡蛎疱疹病毒1型(Ostreid herpesirus-1,OsHV-1)是已知唯一能够感染软体动物的疱疹病毒,属软体动物疱疹病毒科。牡蛎疱疹病毒的主要宿主是双壳贝类和腹足贝类,感染会导致贝类的生长速度减缓,甚至死亡,给贝类养殖产业造成巨大损失,严重危害我国海水贝类养殖业的健康发展。本论文研究牡蛎疱疹病毒1型感染两种太平洋牡蛎以及诱导宿主免疫应答分析。研究结果显示,太平洋牡蛎感染OsHV-1后,总死亡率为32%,48 h时为死亡高峰;透射电镜观察结果表明,闭壳肌内发现了牡蛎疱疹病毒病毒粒子,从内至外形分别是病毒核心、壳衣核、囊膜。应用TaqMan荧光定量PCR检测了OsHV-1感染二倍体、三倍体太平洋牡蛎后的闭壳肌、消化腺、鳃和外套膜等组织中牡蛎疱疹病毒的载量,结果表明,各组织均含有OsHV-1,其中二倍体牡蛎的闭壳肌、消化腺、鳃、外套膜在72、84、84、48h病毒含量最高,分别达到了1.33×10~5、4.45×10~4、5.68×10~4、6.11×10~4 cp/mg;三倍体牡蛎的闭壳肌、消化腺、鳃、外套膜在第2、4、3、2天病毒含量最高,分别达到了5.25×10~4、6.3×10~3、1.86×10~4、1.55×10~5 cp/mg。在观察期内,各组织的病毒含量均是先升高后降低,而后归于平稳,但牡蛎在感染120 h后停止死亡,存活的牡蛎体内仍存在一定含量的OsHV-1;病理组织学研究发现,感染后各器官的结缔组织中都存在组织溶解、细胞脱落和细胞核固缩的现象。应用qPCR方法研究了OsHV-1感染三倍体太平洋牡蛎的细胞因子变化情况。研究结果显示,在感染期间,实验组太平洋牡蛎闭壳肌、消化腺、鳃和外套膜中SOD的表达显著高于对照组;消化腺和闭壳肌中REL的表达显著高于对照组;鳃和消化腺中IL-17的表达显著高于对照组。实验组三倍体牡蛎的MyD88在整个观察期间都显著低于对照组。研究表明,感染OsHV-1后,三倍体太平洋牡蛎的免疫相关因子表达发生了变化,IL-17、REL和SOD的表达量显著升高,这是牡蛎抵御OsHV-1的侵袭的免疫反应;而MyD88的表达量降低,可能与OsHV-1造成的免疫抑制有关。总之,OsHV-1可以感染二倍体和三倍体太平洋牡蛎,在其体内存活并增殖,造成部分宿主的死亡。感染OsHV-1后,牡蛎的免疫相关基因差异表达,IL-17、REL和SOD显著升高,而MyD88呈下降趋势,这是牡蛎抵御OsHV-1侵袭和OsHV-1感染牡蛎的相互作用。本研究证实,OsHV-1可以感染太平洋牡蛎二倍体和三倍体,探明了二倍体和三倍体太平洋牡蛎感染OsHV-1后的病毒载量及对三倍体牡蛎免疫相关基因的差异表达,为进一步研究OsHV-1与宿主的相互作用提供了理论依据。
【学位单位】：山东农业大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2020
【中图分类】：S944.41
【文章目录】：
中文摘要
Abstract
1 前言
    1.1 牡蛎疱疹病毒1 型（OsHV-1）
        1.1.1 牡蛎疱疹病毒1 型（OsHV-1）的流行情况
        1.1.2 牡蛎疱疹病毒1 型（OsHV-1）的临床症状和病理变化
        1.1.3 牡蛎疱疹病毒1 型（OsHV-1）的防治
    1.2 太平洋牡蛎与三倍体
        1.2.1 三倍体牡蛎的优势
        1.2.2 三倍体牡蛎的诱导方式
    1.3 太平洋牡蛎的免疫系统
        1.3.1 IL-17
        1.3.2 REL
        1.3.3 SOD
        1.3.4 MyD88
    1.4 荧光定量
        1.4.1 SYBR GREENⅠ和探针法
        1.4.2 定量方式:绝对定量和相对定量
    1.5 本研究的目的和意义
2 材料和方法
    2.1 实验材料
        2.1.1 患病毛蚶与试验牡蛎
        2.1.2 主要试剂与配制方法
        2.1.3 实验仪器
    2.2 实验方法
        2.2.1 患病毛蚶处理
        2.2.2 DNA模板提取
        2.2.3 PCR检测
        2.2.4 荧光定量PCR检测
        2.2.5 OsHV-1 对太平洋牡蛎二倍体、三倍体致病性的研究
        2.2.6 三倍体牡蛎细胞因子表达检测
3 结果
    3.1 PCR检测和Taq Man荧光定量结果
        3.1.1 建立标准曲线
        3.1.2 患病毛蚶检测结果
    3.2 OsHV-1 对牡蛎的致病性研究
        3.2.1 对牡蛎麻醉的预实验结果
        3.2.2 感染OsHV-1 后牡蛎的症状及存活情况
        3.2.3 二倍体三倍体牡蛎感染OsHV-1 后荧光定量检测结果
    3.3 感染OsHV-1 后三倍体牡蛎的病理组织切片观察和电镜观察
        3.3.1 OsHV-1 感染三倍体的病理组织切片观察
        3.3.2 电镜观察
    3.4 免疫相关基因在不同组织的表达分析
        3.4.1 闭壳肌
        3.4.2 消化腺
        3.4.3 鳃
        3.4.4 外套膜
4 讨论
5 结论
参考文献
致谢
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本文编号：2868303