猪热激蛋白Gp96N端基因与猪瘟病毒E2基因重组表达及重组蛋白的免疫原性研究

发布时间：2020-11-04 03:27

　　 猪瘟病毒E2蛋白是猪瘟病毒(Classical Swine Fever Virus,CSFV)的囊膜糖蛋白,可诱导动物体产生有效的免疫保护,是研究新型疫苗的主要对象。有研究表明,Gp96N端结构区的构象有α螺旋沟,该区域与抗原肽结合能力强,形成的Gp96-抗原肽复合物非常稳定,有潜在的免疫佐剂作用。本研究将Gp96N(26AA-374AA)基因与E2全长基因通过口蹄疫病毒(Foot and Mouth Disease Virus,FMDV)2A基因进行融合,然后分别采用真核和原核系统对该重组基因进行表达,并对原核表达的重组蛋白进行免疫原性的测定以探究Gp96N(26AA-374AA)蛋白与佐剂效果。首先,将甲病毒复制子载体p SFV1进行改造,加入真核CMV启动子和终止区SV40poly A序列,获得一新的表达载体p SCA,然后将EGFP基因、猪瘟病毒E2全长基因及Gp96N端与猪瘟病E2基因的融合片段分别克隆入p SCA载体中,获得p SCA-EGFP、p SCA-E2和p SCA-GE。转染后实验结果表明,p SCA-EGFP质粒能够得到有效表达,p SCA-E2、p SCA-GE能够得到表达,但是p SCA-E2、p SCA-GE质粒表达效率不高和平均荧光值偏低。其次,将E2基因与串联重组蛋白GE基因分别克隆入原核表达载体p ET-32a(+)中得到重组质粒p ET-E2和p ET-GE,转化入Rosetta(DE3)感受态细胞中,分别诱导表达获得融合有组氨酸标签的重组蛋白E2和GE,随后对重组蛋白表达条件进行优化摸索最佳表达条件,并通过梯度尿素法对重组蛋白进行粗纯化和复性;采用SDS-PAGE和Western Blotting实验对目的蛋白进行检测,结果显示表达的重组蛋白为能与抗体特异性反应的目的蛋白。最后,为了研究重组蛋白E2、GE在动物体内的免疫原性,将原核表达的重组蛋白E2、GE和兔化弱毒疫苗以及PBS通过皮下注射免疫小鼠。通过ELISA实验检测免疫鼠血清中猪瘟病毒E2蛋白的抗体水平,结果表明:重组蛋白E2、GE和兔化弱毒疫苗组均产生较高的抗体水平,但是重组蛋白GE免疫组产生的抗体水平反而低于E2重组蛋白免疫组,由此说明Gp96N基因与E2基因串联经过原核表达后可能减弱重组蛋白的免疫效果,推测Gp96N基因与E2基因串联的位置关系可能会对原核表达的重组蛋白的免疫效果产生影响。
【学位单位】：中国兽医药品监察所
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2015
【中图分类】：S852.651
【部分图文】：

加热、缺氧、病毒感染、重金属中毒、氧化剂等子量大小分为 HSP110、HSP90、HSP70、HSP6，不同分子量的 HSP 在细胞内的分布于表达也功能、增强生物体的耐热性、调控细胞骨架动力kDa左右的热激蛋白，是HSP家族中的重要成员界高度保守，细菌、真菌、哺乳动物、植物等都属的 GP96 的 C 末端的四个氨基酸均为 Glu-Glu构特性由 3 个结构域组成：N 端为 ATP 酶活区，也 为信号肽序列；中间为带电的连接区(M)；N-M可能与机体免疫调节相关，其末端含有内质网 端蛋白的佐剂效果一直是研究的热点。Gp96N 端包含多肽结合区，Vogen 等研究发现 Gp96N 端片显示 Gp96 的最小多肽结合位点在其 C 端[43]，源建模，构建出来 Gp96N 端（26AA-374AA）

中国兽医药品监察所硕士学位论文 第一章该结构区的构象有 α 螺旋沟，该区域与抗原肽结合能力强，形成的 Gp96-抗原肽复合物非常稳定，而且有研究表明 MHC-1 类分子也有与其相同构象的肽结合域[44]。并进一步采用DNASTAR 软件对其进一步研究和分析（如下图 1-2），结果发现，Gp96N 端蛋白本身也具有许多诸多潜在的抗原位点，蛋白表面构型严紧，有良好的亲水性，且包含一个可能的跨膜结构域。

SCA、pSCA-E2与pSCA-GE质粒按照4ug的验，具体实验步骤如下：的 24 孔板，吸去培养液，用 1×PBS 漂洗（丙酮：甲醇=1:1），-20℃固定 30min 或用 500uL 1×PBS 洗细胞 3 次，将细胞板中 1×PBS 稀释的 E2 单抗，37℃孵育 1h;液，用 500uL1×PBS 洗细胞 3 次，将细胞板 1×PBS 稀释的荧光二抗，37℃孵育 1h。稀释液，用 500uL 1×PBS 洗细胞 3 次，荧因与 GP96 蛋白基因的扩增及串联号：AF333000.1）基因组为模板，经过反预期的 E2 蛋白基因 PCR 产物的大小相符（
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本文编号：2869542