cAMP-PKA调控玉米大斑病菌极性生长的分子机制

发布时间：2020-11-09 14:42

　　 在我国,玉米种植一直是农业发展的基石,在农业生产中占据很大的比例,玉米作为粮食界的三巨头之一,一直是农业经济的主导,所以其病害对国民经济的影响较大。常见的病害叶部病害包括玉米圆斑病、小斑病和大斑病,本文主要针对玉米大斑病,探索其致病菌——玉米大斑病菌(Setosphaeria turcica)的致病原理及信号通路。玉米大斑病菌是引发玉米大斑病的病原真菌,属典型的丝状真菌,其致病性受cAMP信号转导途径的调控。PKA是cAMP该信号通路的第二信使的主要效应物,它是一个四具体,包含2个调节亚基R和2个催化亚基C。本研究主要目的是明确在玉米大斑病菌的致病过程中,PKA及其下游转录因子StEFG1调控病菌发育及致病性的分子机制。本研究首先验证了 StpkaC2与转录因子StEFG1的互作关系,并鉴定了 StEFG1的下游靶基因StRab1;在△SpkaC1、△SpkaC2菌株中,检测了StRab1基因的表达水平,并利用Rab特异性抑制剂,通过分析抑制剂对病菌表型的影响,明确了 Rab对病菌极性生长的调控作用。此外,根据文献克隆了 PKA下游转录调控因子 Flo8的编码基因StFlo8,明确了StFlo8与2个PKA催化亚基及StEFG1的关系,同时,通过创制△Stflo8菌株,分析该基因的功能,并对其下游互作蛋白进行了筛选。所得主要结果如下:1.通过双分子荧光技术(BiFC)验证了 StEFG1与StpkaC2的互作关系。构建 pSPYCE(M)-StpkaC2、pSPYCE(M)-StEFG1、pSPYNE(R)-StpkaC2、pSPYNE(R)-StEFG14个重组载体,两两组合后导入农杆菌感受态细胞,使重组质粒表达,随后注射入烟草叶片中,观察烟草叶片中的荧光。在注射组合为pSPYCE(M)-StpkaC2::pSPYNE(R)-StEFG1的烟草叶片中能够看到GFP的荧光信号,阴性对照中则未检测到荧光信号,表明,StpkaC2与StEFG1之间存在互作关系。2.通过qPCR检测△SpkaC1、△SpkaC2菌株中与WT菌株差异表达且与菌丝生长有关的基因,获得protein ID为162018的基因。序列分析发现,该基因编码产物与小G蛋白Rab1同源性最高,我们将其命名为StRob1,在△SpkaC2菌株中其表达量达到WT菌株的13倍,且高于△SpkaC1菌株,与前期所得转录组数据相吻合。3.通过凝胶阻滞(EMSA)验证StEFG1与StRob1启动子的互作关系。生信分析发现,StRab1启动子区含有StEFG1的识别序列。将StEFG1进行原核诱导表达,提取并纯化活性蛋白,将活性蛋白与探针(含有StEFG1识别序列的StRab1启动子片段)温育使之结合,使用非变性凝胶分离探针,分析二者的互作关系。探针的长度为30 bp,将探针与StEFG1蛋白进行温育后,在非变性凝胶的80 bp-200 bp之间出现三条主带,表明蛋白与探针结合使探针的迁移速率发生改变,而作为阴性对照的BSA并没有改变探针的迁移速率,表明StEFG1蛋白与探针的结合是特异性的。4.通过qPCR试验检测StRab1基因在玉米大斑病菌侵染过程不同时期的表达量。以成熟菌丝为对照,β-tubulin基因为内参,孢子时期、芽管时期、附着胞时期以及侵入钉时期,该基因的相对表达量分别为:0.24、1.14、1.35、4.51。StRab1在侵入钉时期的表达水平最高,说明其可能在菌丝极性生长过程中发挥重要调控作用。5.通过抑制剂试验验证Rab与菌丝极性生长及几丁质合成的关系。用抑制剂处理后,△SpkaC2突变体的菌丝生长减缓,产孢能力得到一定的恢复;使用共聚焦显微镜观察经几丁质荧光染料着色的菌丝体,发现抑制剂处理的菌丝末端荧光信号减弱,说明几丁质的分布减少,菌丝的末端生长受限。6.通过酵母双杂交试验验证Stflo8与StpkaC1、Stflo8与StEFG1的互作关系。构建pGADT7-StpkaC1/StEFG1/Stflo8、pGBKT7-StpkaC1/StEFG1/Stflo8载体,pGADT7/pGBKT7-Stflo8 与 pGADT7/pGBKT7-StpkaC1、pGADT7/pGBKT7-StEFG1重组质粒进行组合,转入酵母感受态细胞后,在缺陷培养基上培养,结果显示,在SD/-Ade-His-Leu-Trp平板上只有pGADT7-StpkaC1与pGBKT7-Stflo8,pGADT7-Stflo8与 pGBKT7-StEFG1能生长,说明蛋白Stflo8与蛋白StpkaC1和StEFG1之间存在相互作用,而且这种相互作用是特异的。7.创制Stflo8缺失突变体,对该基因的功能进行分析。成功构建了Stflo8敲除载体,并将重组载体转化入病原真菌,创制了Stflo8基因敲除突变体。比较基因缺失突变体与野生型的表型,分析该基因的功能。结果表明,敲除该基因后,病菌的产孢量几乎为0,野生型在疏水介质培养36 h能够形成侵入钉,而突变体无法形成附着胞,同时敲除该基因后病菌的黑色素合成能力减弱。8.通过原核诱导表达Stflo8蛋白,利用Pull-down技术钓取该基因下游与之互作的蛋白。结果获得240多个蛋白在ncbi中进行比对分析,明确其功能及基因家族,统计发现其中6.67%为糖苷水解酶(glycoside hydrolase),4.44%为糖基水解酶(glycosyltransferase),2.22%为碳水化介物酯酶(carbohydrate esterase),其余蛋白质尚未标记其功能。综上所述,SpkaC2通过StEFG1调控StRab1的转录,影响病菌的极性生长;而SpkaC1通过StFlo8间接作用于StEFG1,调控StRab1的转录,对病菌极性生长的影响小于SpkaC2。研究丰富了对病菌cAMP信号途径作用机制的认识,为寻找病害防控新策略奠定了理论基础。
【学位单位】：河北农业大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2020
【中图分类】：S435.131
【部分图文】：

ｔｅｍ?ｏｆ?Ａ?ＳｔｐｋａＣ２＼?Ｃ．?Ｃｏｎｉｄｉｕｍ?ｓｔｅｍ?ｏｆ?Ａ?ＳｌｐｋａＣ２￣Ｃ：?Ｄ．??Ｃｏｎｉｄｉｕｍ?ｓｉｅｎｉ?ｏｆ?Ａ?ＳｔｐｋａＣ２?ｗｈｉｃｈ?ｄｉｓｐｏｓｅｄ?ｈｖ?ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ．??１〇ｌ??ｒｒｒｒ＾?＼ｖｘ??Ｍ〇?８＂?ＦＴ？！?ｍ?ｓ＾ｔｐｋａＣｌ??、６－議發?＾３?＾ｔｐｋａＣ：?Ｃ??Ｔ３?：：：：：￥％??Ｓ?４?ＩＩ：：??；?議：：??０３?鐵？??Ｉ?２－?ＩＩ?鬥??０］＾＾￣￣．????图１１不同菌株孢子产量量化图??Ｉ＇ｉｉ！?１１?ＱｕａｉＨｉＵｃｄ?ｓｐｏｒｅ?ｙｉｅｌｄ?ｏｒｄｉｆｆｃｒｃｎｌ?ｓｔｒａｉｎｓ??１４．３?Ｕａｂ抑制齐ｉｊ对病菌／Ｌ丁质含量及分布的影响??儿Ｔ质的是菌丝极性生长过程中细胞壁的重要组成成分，力菌丝的屮长发育??及侵染过程密切相关，几丁质的含量及分布在病菌侵染的过程中是泠关爪要的，??ｗ此’购调介成儿ｒ质的能力成为病菌侵染能力的．个＿ｃ要指标。比较分析野－十＾??型１Ｊ突变体相关能力从而间接鉴定缺失基因对病菌致病性的调控作Ｈｊ。??八个几Ｉ）贞Ａ成Ｗ浓ｗｔ和Ａ?，Ｓ７／如ｒ２中－＿ＵＷ个Ｍ的表达松式，提収七凇??人斑病保丨野ｚ小．型蘭株ＷＴ、Ａ?５７／＾￡／Ｃ＇２以及Ａ冲？知Ｃ’２－Ｃ等菌株菌丝屮的儿厂??质，迎过检测５３０ｎｍ?Ｋ的提収物溶液的波长来测记提取物中几丁质的含ｍ。??提収液屮儿厂质的含祕越高，则溶液的颜色越深，迎过对提取液进彳Ｔｌ＇ｌ：观观??察发现，及缺尖突变体几Ｔ质提収液的颜＆比野Ａ型更深，而其欠??变体几Ｍ＇质捉収液的颜色则较浅，测定各蘭株儿Ｔ质提取液在波长为６

?河北农业大学硕士学位（毕业）论文???３．６?敲除突变体创制??３．６．１聊沾敲除载体构建??对扩增的同源臂进行凝胶电泳监测，得到两个大小分别为５２０?ｂｐ、４８０?ｂｐ??的片段，￣其基闪序列相符，对两个［ｎｊ源臂片段进行测序，通过ＤＮＡＭＡＮ进行??比较分析，朱见突变，利用该目的片段进行ｆ续载体构建工作。??識二：??图１９敲除载体同源臂１、２菌液ｌ＞ＣＲ检测凝胶电泳检样??Ｆｉｇ．ＩＳ）?Ｋｎｏｃｋｏｕｔ?ｖｅｃｔｏｒ?ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ?ａｒｍ?１．?２?ｂａｃｔｅｒｉａ?ｌｉｑｕｉｉｌ?ＰＣＲ?ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ?ｇｅｌ?ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ?ｓａｍｐｌｅ．??３．６．２?Ａ?Ｓｌｆｈ）Ｈ＾｝＼％＼＼??将新逑的敲除载体通过ＰＥＧ介导的方式转化到玉米大斑病菌中，在具有抗??中素的培奍姑屮进行初步筛选，通过抗性筛选，得到部分转化子，进—步在抗性??培养站中纯化转化了，待转化子能够稳定屮长后，进一步进行ＤＮＡ水平的检测，??提取转化丫？及野屯型的基因纟丨１?ＤＮＡ，以构让的敲除载体的质粒为模板作为阳性??对照，以玉米人斑病调野中型轴Ｗ组ＤＮＡ为模板作为阴性对照，对同源臂￣筛??选标记的连接部位进行扩增，结见Ｖ小，把／Ｈ？佘株转化子中，釕…株能够扩增??，ｌｌｌ，人小为９２６ｂｐ的条带，ｌＲ＾ａ式验Ｍ，＾到扣Ｍ的试验结见，获得？株阳性转??化子，将该转化子进－步纯化ｆ进行炎型观察以分析基因功能。??图２０?ｌ）ＮＡ水平验证转化子电泳检样图??ｌ?ｉｉ！?２０?ＤＮＡ?ｌｅｖｅｌ?＼ｃｎｌｉｃａｌｉｏｎ?ｉｍｃｒｌｃｒ?ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ?ｄｉａｇｒａｍ??从左到右依次为ＭｍｋＴ

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本文编号：2876577