芥菜开花整合子SOC1的启动子克隆及其与FLC、SVP蛋白相互作用

发布时间：2020-11-13 06:13

　　 适宜的开花时间对于植物的生殖生长及其产品器官的产量和品质非常重要,因此植物进化出复杂且精细的调控机制来调控开花时间。芥菜(Brassica juncea Coss)是十字花科芸薹属蔬菜,起源于亚洲,在我国南方大面积种植。因此,芥菜开花时间基因调控网络的研究,对于生产指导和科学研究都有非常重要的意义。近30年对模式植物拟南芥基因的研究表明开花遗传调控网络由6个途径相互作用调控：光周期途径,自主途径,春花途径,赤霉素途径,环境温度途径,年龄途径。这六个途径主要由一些开花整合子基因调控,这些基因编码不同的蛋白,通过整合多个途径中的信号从而调控开花时间,例如开花信号整合子SUPPRESSOR OF OVEREXPRESSION OF CONSTANS1 (SOC1),它能够整合低温春化途径核心调控因子FLOWERING LOCUS C (FLC和光周期途径核心调节因子SHORT VEGETATIVE PHASE (SVP)的开花信号。但是,芥菜SOCl基因是否受到FLC和SVP蛋白的转录调控?FLC和SVP蛋白能否直接结合到SOCl基因启动子上抑制SOCl基因的表达?目前并不清楚。本试验以芥菜为研究材料,根据SOCl已知基因序列设计特异性引物,利用染色体步移法克隆出SOCl的启动子,并且利用生物信息学分析启动子的关键调控元件。构建SOCl启动子及SVP、FLC的酵母单杂交重组表达载体,通过酵母单杂交系统进一步鉴定及分析SOCl启动子与SVP、FLC蛋白相互作用,以期为SOC1基因的转录调控等深入研究奠定基础。1、SOC1启动子的克隆及生物信息学分析提取芥菜基因组DNA,根据芥菜SOC1已知基因序列设计特异性引物,利用染色体步移法从芥菜gDNA中克隆出未知SOCl启动子序列。获得的SOC1启动子为782bp,进化分析表明芥菜SOCl的启动子与拟南芥SOCl的启动子关系最近,与高山南芥SOCl的启动子亲缘关系最远。对其顺式元件生物信息学分析发现,该序列中含有TATA-box核心启动子元件、CAAT-box等上游启动子元件以及多种应答元件。2、SOC1的启动子克隆与FLC、SVP蛋白相互作用的检测设计带有HindⅢXhoⅠ酶切位点的引物,亚克隆SOC1的启动子基因序列。构建SOC1启动子、SVP. FLC的酵母表达载体pAbAi-SOC1、pGADT7-FLC、 pGADT7-SVP。利用酵母转化系统操作手册将线性化的酵母重组质粒pAbAi-SOC1转化到酵母感受态细胞中,得到相应的酵母转化子YIH (pAbAi-SOC1)。SD/-Ura平板上30℃倒置培养3-5d,发现酵母转化子能够正常生长,表明线性化pAbAi-SOC1重组质粒已成功导入酵母基因组中。进一步在SD/-Ura/AbA*缺陷培养基上筛选AbA抗性浓度,结果表明AbA100ng/ml下,假阳性就能够很好地被抑制。然后进行二次转化,将pGADT7-FLC、pGADT7-SVP重组质粒转化到Y1H(pAbAi-SOC1)酵母感受态细胞中,发现YIH (pAbAi-SOC1×pGADT7-FLC)、YIH (pAbAi-SOC1 ×pGADT7-SVP)都能在SD/-Leu/AbA100上正常生长,结果说明克隆得到的芥菜SOCl启动子能够与FLC、SVP蛋白发生相互作用,为进一步研究它们的作用位点提供了基础。3、SOC1启动子与FLC、SVP蛋白相互作用关键区域的预测在拟南芥的研究中发现,MADS-box蛋白会特异性结合到CArG-box (MADS蛋白结合元件)上,从而激活或抑制下游基因的表达。SVP、FLC蛋白属于MIKC型MADS-box蛋白,因此我们分析了SOC1启动子序列,并没有发现与拟南芥SOC1启动子中序列完全一致的CArG-box,但是找到了三个类似的CArG-box,并推测这三个位点可能是SOC1基因的启动子与SVP、FLC蛋白的相互作用位点。
【学位单位】：西南大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2015
【中图分类】：S637;Q943.2
【部分图文】：

第〗章文献综述???ＤＳ－ｂｏｘ蛋白复合物的形成和激活转录的作用［５１］。但是，在拟南芥ＳＥＰ３蛋白的??宄中发现，Ｃ域的有无对多聚化影响不大，而在Ｃ域缺失时，Ｋ３子域对多聚化??着重要的作用［５２］。??ＭＩＫＣ型蛋白含有多种蛋白与蛋白相互作用的基序（这些基序对它的分子活性??关键），与其他调节蛋白共享其分子结构。ＭＩＫＣ型蛋白二聚体和高级复合物提??了一个增强功能特异性的理想模型，这反映在不同的复合体对ＤＮＡ的不同绑定??力［５３］。被子植物的ＭＡＤＳ蛋白参与调控多种发育过程，如幵花时间、花分生组??特性，果实发育等。??

出３条退火温度较高，ＧＣ含量在４５？５５％，长度为２２？２６ｎｐ的特异性引物（ＳＰ１，??ＳＰ２，?ＳＰ３）。设计引物的方向为未知序列方向，ＳＰ２应设计在ＳＰ１的内侧，ＳＰ３在??ＳＰ２的内侧（图１－２）。特异性引物与位于未知序列的４个随机简并引物（Ａｒｂｉｔｒａｒｙ??Ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ?Ｐｒｉｍｅｒ，?ＡＰ）形成弓丨物对，经过３次巢式ＰＣＲ?（ｎｅｓｔｅｄ?ＰＣＲ）后获得目??６??

在酵母单杂交体系中，将ＧＡＬ４的ＤＮＡ结合结构域置换为其它蛋白，并且用??特异的ＤＮＡ序列（Ｂａｉｔ）取代ＧＡＬ４的ＤＮＡ结合位点，该ＤＮＡ序列在相关生物??系统中是重要的蛋白质结合位点（如图１－３）。目标ＤＮＡ序列特异的结合蛋白（Ｐｒｅｙ）??与ＧＡＬ４的激活结构域可融合形成融合体，Ｐｒｅｙ与其特异性ＤＮＡ结合位点之间通??过相互作用可激活作为表型选择性标志的报告基因ＡｂＡ■■的表达［８１］。理论上，酵母??单杂交体系可利用祀ＤＮＡ序列，捕获具有与该元件特异结合的结构域的蛋白质。??该体系不仅适用于识别转录因子，也适用于研究参与转录抑制和ＤＮＡ复制过程的??蛋白质。??１１??
【参考文献】

相关期刊论文 前2条

1 赵学彬;唐桂英;单雷;;植物Ⅱ型启动子功能研究的常用方法及其进展[J];生命科学;2013年06期

2 杨晓娜;赵昶灵;李云;李会容;苏丽;周燕琼;;启动子序列克隆和功能分析方法的研究进展[J];云南农业大学学报(自然科学版);2010年02期

本文编号：2881846