马铃薯StMAPKK1互作蛋白筛选及其互作蛋白基因功能解析

发布时间：2020-11-13 06:33

　　 促分裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase,MAPK)级联反应是植物生长发育、激素及胁迫的响应信号通路中重要信号网络之一。MAPKKs是其主要成员之一,在该级联反应中位于通路中间、对信号传递起着收集和发散的关键作用的激酶。本实验室前期工作中,对马铃薯(Solanum tuberosum L.)StMAPKKs家族基因进行了鉴定,共鉴定出5个StMAPKKs基因,不同胁迫处理下马铃薯StMAPKKs基因荧光定量PCR结果发现,在干旱胁迫下该基因家族中StMAPKK1基因表达量升高最为显著。所以,本研究旨在对鲜有报道的StMAPKK1基因的调控功能及信号通路上的互作蛋白进行挖掘和解析,以期为深入研究马铃薯抗逆应答反应中的MAPK、MAPKK及MAPKKK信号传导级联系统的分子机理和代谢网络奠定基础。为此,本研究用生物信息学方法对StMAPKK1基因进行了序列和功能分析;使用同源重组方法构建了酵母(Saccharomyces cerevisiae)双杂交系统诱饵载体pGBKT7-StMAPKK1、亚细胞定位表达载体pCEGFP-StMAPKK1以及双分子荧光互补表达载体pSPYCE-StMAPKK1和pSPYNE-StMAPKK1;利用酵母双杂交技术从马铃薯‘紫花白’酵母双杂交cDNA文库经过大量筛选,获得了与马铃薯StMAPKK1相互作用的蛋白质;对筛选出的马铃薯StMAPKK1互作蛋白基因进行了生物信息学基因序列分析及基因功能注释。取得了以下主要研究结果:1.采用生物信息学分析发现,马铃薯StMAPKK1是等电点为5.47的稳定蛋白质和亲水蛋白质,无信号肽和跨膜结构域,含有丝氨酸和苏氨酸为主的蛋白磷酸化位点,含有Protein kinase domain(PF00069)结构域。StMAPKK1基因定位于细胞质中,含有涉及植物激素ABA、GA_3和乙烯响应相关、植物逆境胁迫干旱响应、厌氧诱导和损伤应答相关以及光响应相关的顺式作用元件。StMAPKK1基因在组织中表达存在特异性,在生物胁迫BABA和晚疫病病菌处理下,以及非生物胁迫ABA、BAP和水分胁迫处理下基因表达量显著变化。STRING v11.0中共预测出5种StMAPKK1互作蛋白,包括2种StMAPKKK蛋白,1种StMAPK蛋白,1个真核翻译起始因子3的B亚基蛋白以及1个未被鉴定的蛋白质。2.克隆了马铃薯StMAPKK1基因,采用同源重组方法构建了StMAPKK1基因酵母双杂交诱饵载体pGBKT7-StMAPKK1,并将该诱饵载体转入酵母Y187中,进行检测证明该诱饵载体对酵母菌株无毒性和无自激活活性,可用于进一步酵母双杂交实验。3.采用酵母双杂交方法,使StMAPKK1诱饵蛋白与马铃薯cDNA文库杂交,杂交液共涂布于50个四缺QDO培养基上培养,挑选出直径较大的、呈白色或浅粉色的单菌落406个,通过初步X-α-Gal染色初步鉴定筛选,其中210个菌落在48 h内生长并显蓝色,视其为阳性克隆,阳性率为51.72%。对阳性克隆进行PCR电泳检测和测序,合并重复、冗余测序结果,最终筛选出5种与StMAPKK1互作的蛋白质阳性克隆,分别命名为C1-C5。5种阳性克隆均通过小规模杂交验证互作真实性。4.对StMAPKK1互作蛋白阳性克隆进行测序和Blast比对分析,鉴定得到的5个StMAPKK1互作蛋白基因C1-C5分别为:水解酶(水解O-糖基化合物)、RING-H2亚家族RHE蛋白、氰酸酯酶、ARF GTPase活化因子以及一个含有C2结构域的蛋白。通过生物信息学分析发现,StMAPKK1互作蛋白均为亲水性蛋白,且均含有数量不等的蛋白磷酸化位点。除C2基因可能定位于叶绿体类囊体膜或细胞核之外,其它StMAPKK1互作蛋白基因均定位于在细胞质中。StMAPKK1互作蛋白基因均含有植物生长发育相关、激素和胁迫响应相关顺式作用元件,并在组织表达及生物胁迫和非生物胁迫响应中具有特异性。5.构建了亚细胞定位表达载体pCEGFP-StMAPKK1可以用于后续StMAPKK1基因的亚细胞定位研究;构建了双分子荧光互补表达载体pSPYCE-StMAPKK1和pSPYNE-StMAPKK1,将用于StMAPKK1与其5个互作蛋白双分子荧光互补实验,对上述5对蛋白互作关系进行进一步验证。
【学位单位】：甘肃农业大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2020
【中图分类】：S532
【部分图文】：

马铃薯StMAPKK1基因(PGSC0003DMT400000744)CDs长度为1073 bp。亚细胞定位表达载体pCEGFP以及双分子荧光互补表达载体pSPYCE-35S和pSPYNE-35S仅插入CDs序列,并末端去除终止子序列,使得载体表达马铃薯StMAPKK1蛋白末端可以连接荧光蛋白。根据同源重组引物设计原则插入片段5’和3’末端分别带有和线性化载体两端对应的同源序列(包括酶切位点序列)21 bp,故亚细胞定位表达载体pCEGFP以及双分子荧光互补表达载体pSPYCE-35S和pSPYNE-35S StMAPKK1基因PCR产物大小均为1112 bp,与电泳结果相符(图6.1)。6.3.2 亚细胞定位表达载体和双分子荧光互补表达载体线性化

亚细胞定位表达载体以及双分子荧光互补表达载体酶切线性化电泳检测

重组质粒大肠杆菌菌液PCR检测结果符合的菌液进行测序,将目的基因片段已正确插入的载体分别命名为pCEGFP-StMAPKK1、pSPYCE-StMAPKK1和p SPYNE-StMAPKK1。提取质粒,并保存于-20℃备用。6.4 讨论
【参考文献】

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本文编号：2881864