花椒DNA提取方法及条形码鉴定研究

发布时间：2020-11-13 16:09

　　 芸香科(Rutaceae)花椒属(Zanthoxylum)植物在我国有39种,目前对其区分主要以形态鉴定为主。DNA条形码鉴定是一种新型的物种鉴定方法,是利用基因组中一段相对较短的片段对物种进行鉴定的分子技术。本实验探究对花椒属植物不同材料样本DNA提取方法的优化,使用DNA条形码鉴定方法对花椒属9种植物共121份样本使用ITS2序列进行鉴定研究,旨在使用分子鉴定的手段准确地对花椒属植物进行鉴定,并尝试使用ITS2序列对花椒(Z. Bungeanum)及竹叶花椒(Z. armatum)种内的不同品种进行鉴定。主要研究内容及结果如下：(1)使用在DNA提取中较为常见的两种方法CTAB法及试剂盒法,对本次实验采集的花椒属121份样本进行提取与改良,结果表明,两种方法对新鲜叶片及经过硅胶干燥叶片材料的DNA提取均能获得成功,果皮类材料经过改良提取方法：在加入DNA提取液之前,使用核分离液洗涤3次,水浴时间1h,也能成功提取DNA。两种方法均能获得符合PCR要求的总DNA。PC后电泳检测条带明亮、单一,其样本经测序、序列拼接及注释剪切后共获得121条ITS2序列。(2)使用ITS2片段对花椒属植物进行鉴定,结果表明ITS2序列能够有效鉴定本次实验收集的花椒属9种植物,除花椒Z. Bungeanum以外,8种植物的种内最大K2P距离均小于与其余物种间的种间最小K2P距离,可以明显与其余物种进行区分。各物种在ITS2序列中有稳定区别于其他8个物种的位点,可作为鉴别花椒属9种植物的辅助手段,能将花椒属9种植物进行良好地区分。邻接(NJ)法构建的系统聚类树,各物种均能各自聚为一支,能较好地与其他物种较好地区分开。(3)在使用ITS2序列对花椒及竹叶花椒的品种进行鉴定时,花椒种内4个品种中,汉源花椒、越西贡椒及灵山正路椒ITS2序列一致,无法使用ITS2序列进行鉴定区分,但来自四川松潘、茂县、汶川的花椒样本与甘肃礼县、临夏、天水的花椒样本在3个位点上一致表现出与其余产地花椒样本的差异。竹叶花椒种内3个品种在ITS2序列上并无稳定、明显差异。DNA条形码技术能够准确、快速地对花椒属9种植物进行鉴定。
【学位单位】：四川农业大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2015
【中图分类】：S573.9
【文章目录】：
摘要
Abstract
1 文献综述
    1.1 花椒属植物研究现状
        1.1.1 花椒属植物概述
        1.1.2 花椒的化学成分及药理作用
        1.1.3 花椒属植物的误用问题
        1.1.4 花椒属植物鉴定研究
        1.1.5 花椒的品种
        1.1.6 花椒属植物DNA提取方法
    1.2 DNA条形码技术
        1.2.1 DNA条形码的定义
        1.2.2 DNA条形码鉴定方法及原理
        1.2.3 DNA条形码的应用历史
        1.2.4 植物DNA条形码的筛选
        1.2.5 DNA条形码鉴定方法的特点
        1.2.6 ITS2序列
        1.2.7 ITS2序列在中药材鉴定方面的应用
2 研究目的及意义
3 研究内容与方法
    3.1 研究材料
    3.2 研究内容
    3.3 研究方法
        3.3.1 DNA提取方法探究
        3.3.2 ITS2序列扩增
        3.3.3 峰图质量评价与拼接
        3.3.4 ITS2序列验证
        3.3.5 种间种内变异分析及邻接树图的建立
4 结果与分析
    4.1 DNA提取方法
    4.2 凝胶电泳检测
    4.3 序列拼接及序列验证
    4.4 种内种间变异分析
    4.5 各物种单倍型及变异位点分析
    4.6 花椒及竹叶花椒种内品种间变异分析
    4.7 种间ITS2序列聚类分析
5 讨论
    5.1 花椒属植物提取方法
    5.2 ITS2序列对花椒属植物的鉴定能力
    5.3 ITS2序列对品种的鉴定能力
    5.4 花椒属分类的讨论
6 主要结论
7 本实验的不足与展望
8 参考文献
致谢
附录
攻读学位期间发表的学术论文

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本文编号：2882367