束缚应激与CRH升高通过激活TNF-α系统损伤小鼠卵母细胞的发育能力
发布时间：2020-11-13 20:12
随着社会的发展,生活节奏的加快,人们承受的心理压力越来越大,心理应激会造成雌性生殖障碍,导致不孕,流产等各种疾病。束缚应激是最经典的心理应激模型之一。研究表明束缚应激会激活HPA(下丘脑-垂体-肾上腺)轴,并导致血清和卵巢中促肾上腺皮质激素释放激素(Corticotrophin-releasing Hormone,CRH)含量升高从而诱导壁颗粒细胞凋亡,但其机制尚不清楚。实验室前期研究表明CRH水平升高通过Fas/FasL系统诱导壁颗粒细胞及卵母细胞的凋亡;但FasL突变的gld小鼠实验中,也存在束缚应激诱导细胞凋亡,这表明束缚应激可能激活除Fas/FasL系统以外的其他通路。TNF-α系统同样可以诱导多种组织和细胞的凋亡,但应激过程中CRH是否也会通过TNF-α系统诱导壁颗粒细胞(MGCs)凋亡,从而损伤卵母细胞的发育能力却未见报道。本研究验证束缚应激与CRH升高是否通过TNF-α系统影响卵母细胞的发育能力。通过体内、体外实验检测小鼠卵母细胞发育能力、MGCs与卵母细胞的凋亡情况以及TNF-α系统的激活来探究束缚应激通过TNF-α系统损伤卵母细胞发育能力的机制。在卵母细胞未成熟时给予束缚应激,体内实验结果表明,束缚应激后,小鼠囊胚率与囊胚细胞数均显著下降,卵母细胞及壁颗粒细胞的凋亡比例显著增加,血清、卵巢及壁颗粒细胞中的TNF-α与TNFR1蛋白表达量均显著升高。体外实验结果表明,培养壁颗粒细胞,CRH处理组壁颗粒细胞的TNF-α与TNFR1蛋白表达量和细胞凋亡比例均显著升高,而同时添加CRH及其拮抗剂antalarmin后,壁颗粒细胞中TNF-α与TNFR1蛋白表达量和细胞凋亡比例与添加CRH组相比均显著下降,CRH的损伤作用被逆转。通过体内敲除TNF-α、注射TNF-α拮抗剂etanercep以及RNAi技术体外敲低TNF-α均可显著减轻束缚应激及CRH对卵母细胞发育能力和凋亡及MGCs凋亡的不利影响。结果表明束缚应激及CRH的升高可以通过激活TNF-α系统影响卵母细胞的发育能力,且可采用TNF-α拮抗剂来改善心理应激对卵母细胞的不利影响。
【学位单位】：山东农业大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2020
【中图分类】：S852.2
【部分图文】：
山东农业大学硕士专业学位论文23图3-1束缚应激对卵母细胞中Bcl-2、Bax表达的影响Figure3-1EffectsofrestraintstressonBcl-2/Baxlevelsinoocyte注：束缚时间为48h，图A：Bcl-2mRNA水平；图B：BaxmRNA水平；图C：Bcl-2/Bax比值。每组实验重复3次。a,b:表中每列字母相同表示差异未达显著水平（p>0.05），不同则表示差异达到显著水平（p<0.05）Note:RS,48hRestraintStress.A,relativeBcl-2mRNA;B,relativeBaxmRNA;C,relativeBcl-2/BaxmRNAEachtreatmentwasrepeated3times.a,b:Valueswithdifferentlettersinrightsideofthesamelistdiffersignificantly(p<0.05)由上图可知，与对照组相比，束缚48h后，Bcl-2mRNA水平显著降低，BaxmRNA水平显著升高，且Bcl-2/Bax比值对照组显著高于束缚组。其中Bcl-2是抑凋亡基因，Bax是促凋亡基因，结果表明，束缚应激后，小鼠卵母细胞凋亡率显著高于对照组。即束缚应激影响凋亡基因表达，导致卵母细胞凋亡。3.3束缚应激对TNF-α系统的影响由于束缚应激导致卵巢细胞的凋亡率显著升高，为了验证束缚应激通过激活TNF-α系统导致卵巢细胞凋亡，进而损伤的卵母细胞发育能力这一实验猜想，我们通过以下实验来检验，首先检测了TNF-α系统是否被激活。ABC
束缚应激与CRH升高通过激活TNF-α系统损伤小鼠卵母细胞的发育能力243.3.1束缚应激对卵母细胞中TNFR1表达的影响上述实验证明束缚应激损伤卵母细胞发育能力且诱导卵母细胞凋亡，因此首先检测卵母细胞中TNF-α系统是否被激活。收集GV期卵母细胞，加入RIPA裂解液，用WesternBlot检测TNFR1的表达情况。每个处理重复3次，每组重复对照组与束缚组各约240个卵母细胞。图3-2束缚应激对卵母细胞中TNFR1表达的影响（体内）Figure3-2EffectsofrestraintstressonTNFR1proteinofoocyte(invivo)由上图可知，对照组相对蛋白表达量为1，束缚组相对蛋白表达量为1.80。与对照组相比，束缚应激后小鼠卵母细胞中的TNFR1水平显著升高（P<0.05），即束缚应激激活卵母细胞中的TNF-α系统。3.3.2束缚应激对血清中TNF-α表达的影响实验共用18只小鼠，对照组与束缚组各9只，每3只充分混合组成一个样本。用ELISA试剂盒检测血清中TNF-α的表达量。
山东农业大学硕士专业学位论文25图3-3束缚应激对血清中TNF-α表达的影响Figure3-3EffectsofrestraintstressonTNF-αlevelsinserum注：束缚时间为48h。每组实验重复3次。a,b:表中每列字母相同表示差异未达显著水平（p>0.05），不同则表示差异达到显著水平（p<0.05）Note:RS,48hRestraintStress.Eachtreatmentwasrepeated3times.a,b:Valueswithdifferentlettersinrightsideofthesamelistdiffersignificantly(p<0.05)由上图可知，对照组血清中的TNF-α表达量为26.92pg/mL，束缚48h后TNF-α表达量为47.36pg/mL。与对照组相比，束缚应激后小鼠血清中的TNF-α水平显著升高（P<0.05）。3.3.3束缚应激对卵巢匀浆中TNF-α表达的影响实验共用18只小鼠，对照组与束缚组各9只，每3只充分混合组成一个样本。用ELISA试剂盒检测卵巢匀浆中TNF-α的表达量。图3-4束缚应激对卵巢匀浆中TNF-α表达的影响Figure3-4EffectsofrestraintstressonTNF-αlevelsinovary注：束缚时间为48h。每组实验重复3次。a,b:表中每列字母相同表示差异未达显著水平（p>0.05），不同则表示差异达到显著水平（P<0.05）Note:RS,48hRestraintStress.Eachtreatmentwasrepeated3times.a,b:Valueswithdifferentlettersinrightsideofthesamelistdiffersignificantly(P<0.05)
【参考文献】
本文编号：2882589
【学位单位】：山东农业大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2020
【中图分类】：S852.2
【部分图文】：
山东农业大学硕士专业学位论文23图3-1束缚应激对卵母细胞中Bcl-2、Bax表达的影响Figure3-1EffectsofrestraintstressonBcl-2/Baxlevelsinoocyte注：束缚时间为48h，图A：Bcl-2mRNA水平；图B：BaxmRNA水平；图C：Bcl-2/Bax比值。每组实验重复3次。a,b:表中每列字母相同表示差异未达显著水平（p>0.05），不同则表示差异达到显著水平（p<0.05）Note:RS,48hRestraintStress.A,relativeBcl-2mRNA;B,relativeBaxmRNA;C,relativeBcl-2/BaxmRNAEachtreatmentwasrepeated3times.a,b:Valueswithdifferentlettersinrightsideofthesamelistdiffersignificantly(p<0.05)由上图可知，与对照组相比，束缚48h后，Bcl-2mRNA水平显著降低，BaxmRNA水平显著升高，且Bcl-2/Bax比值对照组显著高于束缚组。其中Bcl-2是抑凋亡基因，Bax是促凋亡基因，结果表明，束缚应激后，小鼠卵母细胞凋亡率显著高于对照组。即束缚应激影响凋亡基因表达，导致卵母细胞凋亡。3.3束缚应激对TNF-α系统的影响由于束缚应激导致卵巢细胞的凋亡率显著升高，为了验证束缚应激通过激活TNF-α系统导致卵巢细胞凋亡，进而损伤的卵母细胞发育能力这一实验猜想，我们通过以下实验来检验，首先检测了TNF-α系统是否被激活。ABC
束缚应激与CRH升高通过激活TNF-α系统损伤小鼠卵母细胞的发育能力243.3.1束缚应激对卵母细胞中TNFR1表达的影响上述实验证明束缚应激损伤卵母细胞发育能力且诱导卵母细胞凋亡，因此首先检测卵母细胞中TNF-α系统是否被激活。收集GV期卵母细胞，加入RIPA裂解液，用WesternBlot检测TNFR1的表达情况。每个处理重复3次，每组重复对照组与束缚组各约240个卵母细胞。图3-2束缚应激对卵母细胞中TNFR1表达的影响（体内）Figure3-2EffectsofrestraintstressonTNFR1proteinofoocyte(invivo)由上图可知，对照组相对蛋白表达量为1，束缚组相对蛋白表达量为1.80。与对照组相比，束缚应激后小鼠卵母细胞中的TNFR1水平显著升高（P<0.05），即束缚应激激活卵母细胞中的TNF-α系统。3.3.2束缚应激对血清中TNF-α表达的影响实验共用18只小鼠，对照组与束缚组各9只，每3只充分混合组成一个样本。用ELISA试剂盒检测血清中TNF-α的表达量。
山东农业大学硕士专业学位论文25图3-3束缚应激对血清中TNF-α表达的影响Figure3-3EffectsofrestraintstressonTNF-αlevelsinserum注：束缚时间为48h。每组实验重复3次。a,b:表中每列字母相同表示差异未达显著水平（p>0.05），不同则表示差异达到显著水平（p<0.05）Note:RS,48hRestraintStress.Eachtreatmentwasrepeated3times.a,b:Valueswithdifferentlettersinrightsideofthesamelistdiffersignificantly(p<0.05)由上图可知，对照组血清中的TNF-α表达量为26.92pg/mL，束缚48h后TNF-α表达量为47.36pg/mL。与对照组相比，束缚应激后小鼠血清中的TNF-α水平显著升高（P<0.05）。3.3.3束缚应激对卵巢匀浆中TNF-α表达的影响实验共用18只小鼠，对照组与束缚组各9只，每3只充分混合组成一个样本。用ELISA试剂盒检测卵巢匀浆中TNF-α的表达量。图3-4束缚应激对卵巢匀浆中TNF-α表达的影响Figure3-4EffectsofrestraintstressonTNF-αlevelsinovary注：束缚时间为48h。每组实验重复3次。a,b:表中每列字母相同表示差异未达显著水平（p>0.05），不同则表示差异达到显著水平（P<0.05）Note:RS,48hRestraintStress.Eachtreatmentwasrepeated3times.a,b:Valueswithdifferentlettersinrightsideofthesamelistdiffersignificantly(P<0.05)
【参考文献】
相关期刊论文 前2条
1 赵书涛;武晓东;王策;陈永勤;唐玉国;;流式细胞仪的原理、应用及最新进展[J];现代生物医学进展;2011年22期
2 Bencomo E.;Pérez R.;ArteagaM.-F.;A. Palumbo;马超;;胰岛素样生长因子I降低黄体颗粒细胞凋亡,与胚胎破碎和妊娠率相关[J];世界核心医学期刊文摘(妇产科学分册);2006年Z1期
本文编号：2882589
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