精子载体制备转基因鸡方法研究

发布时间：2020-11-17 05:37

　　 精子载体介导的转基因技术操作简单,成本低廉,自Lvaitran 1989年提出以来受到了人们的广泛关注。但是由于精子载体法精子存在在体外与外源DNA共孵育使精子活力下降影响与卵细胞结合使受精困难、外源DNA无法整合到动物细胞基因组等缺陷,很大程度上限制了精子载体技术的发展与应用。CRISPR/Cas9系统目前已经在众多研究人员实验结果中表现出强大的定点基因编辑能力,这一特点和精子载体法相结合制备基因编辑(基因突变)的遗传修饰的转基因动物具有一定的可行性。探讨将两个技术结合制备基因编辑鸡在目前转基因鸡制备技术尚不成熟的情况下,具有重要的意义。因此,本试验旨在通过以鸡生长激素受体基因(Growth hormone receptor,GHR)为模型,筛选出高效的sgRNA,建立精子载体脂质体孵育条件,将CRISPR/Cas9系统与精子载体技术结合,期望建立简单高效廉价的制备遗传修饰鸡的方法。主要研究内容及结果如下:高活性sgRNA体外酶切筛选:实验首先根据矮小型鸡生长激素受体基因缺失部分的外显子区用在线sgRNA设计软件设计5对sgRNA序列,并且分别构建出前边插入了 T7启动子的sgRNA的体外转录载体pT7-sgRNA-trac,转录出对应的sgRNA。按照Cas9体外酶切试剂盒说明书将Cas9蛋白、sgRNA和体外切割底物按比例混合孵育,酶切结果用1%琼脂糖凝胶电泳检测,结果:sgRNA1体外切割效率为82.1%,sgRNA2体外切割效率为57.4%,sgRNA3体外切割效率为92.5%,sgRNA4体外切割效率为33.7%,sgRNA5体外切割效率为95.4%。sgRNA活性的DF-1细胞内鉴定及sgRNA脱靶分析:选择靶向GHR基因体外酶切效率较高的sgRNA1、sgRNA3、sgRNA5,构建出相应的sgRNA、Cas9蛋白和EGFP共表达载体。构建左右同源臂质粒载体pMD19T-zyb,将Neo R表达结构和左右同源臂连接构建打靶载体pMD19T-Neo-zyb。将sgRNA、Cas9蛋白和EGFP共表达载体分别和打靶载体共转染DF-1细胞,用G418筛选,挑单克隆细胞并且增殖培养,将所有阳性单克隆细胞基因组DNA通过PCR扩增鉴定NeoR定点插入,并且将鉴定未定点插入的单克隆细胞基因组通过PCR扩增GHR基因检测靶点处基因序列并进行测序鉴定靶位点处是否发生编辑,其中sgRNA1获得16株细胞克隆有2株为定点插入阳性,编辑效率为12.5%;sgRNA3获得23株细胞克隆有9株为定点插入阳性,2株为未定点插入但靶点序列发生突变,编辑效率为47.8%;sgRNA5获得24株细胞克隆有11株为定点插入阳性,2株为未定点插入但靶点序列发生突变,编辑效率为54.2%。根据在线脱靶分析软件设计对sgRNA1、sgRNA3、sgRNA5分别选出5个潜在脱靶位点,并设计相应引物,以筛选到的所有Neo R抗性为阳性的细胞克隆基因组为模板PCR扩增出对应潜在脱靶位点序列并测序:分别选出的5个潜在脱靶位点均未检测到sgRNA发生脱靶。精子孵育条件建立:采集新鲜公鸡精液,取200μL精液,洗涤液同孵育液洗涤精清,孵育液分别为稀释液、DMEM培养基、1640培养基、PBS缓冲液,孵育时间分别为10min、30min、60min、90min,观察精子活力选择合适的孵育液,选择能维持精子较高活力的孵育液分别与pX330质粒共孵育10min、30min、60min、90min,观察精子活力并且以半定量PCR鉴定摄取外源DNA情况筛选出最优孵育时间;另一组试验为孵育前分别用0μL、1μL、1.5 μL、2 μL脂质体包被质粒DNA,孵浴时间60 min,半定量PCR鉴定摄取外源DNA情况及有活力的精子所占比例综合选择合适的脂质体体积;通过人工授精,比较不同孵育方法受精率,并PCR鉴定携带外源DNA的受精蛋胚盘数以确定最佳孵育方法。结果不同孵育液孵育后,M199培养液做为孵育液孵育后有活力的精子所占比例显著高于其他组(P0.05),孵育时间60 min时为最佳孵育时间;脂质体孵育最佳的脂质体用量为1.5μL;普通孵育处理的受精率为51.18%,脂质体孵育处理的受精率为44.78%,差异不显著(P0.05),简单孵育外源DNA 阳性率为14.94%,脂质体孵育外源DNA 阳性率28.89%,差异显著(P0.05)。编辑胚胎或个体的鉴定:将DF-1细胞筛选高效的sgRNA、Cas9蛋白、EGFP共表达载体与精子在建立的合适孵育条件下脂质体共孵育,人工授精,第X期胚盘水平和刚出壳雏鸡组织水平检测基因编辑:第X期胚盘1087枚,鉴定出3枚受精蛋发生基因编辑,初步估计编辑效率为0.28%,发生基因编辑的3枚受精蛋中发生基因编辑细胞数分别占第X期总细胞数的比例初步估计为10.4%、12.5%、10.4%,经鸡胚基因组DNA进行PCR鉴定性别,发生基因编辑的3枚受精蛋均为雌性,推测CRISPR/Cas9系统发生基因编辑的时期在受精卵发育到8细胞期之前;雏鸡组织未鉴定出发生基因编辑的样品,导致的原因可能是多样的。本试验通过将筛选靶向GHR基因的高效sgRNA,建立适合鸡精子载体的孵育条件,将两者相结合,在第X期胚盘中实现了定点基因编辑,为矮小鸡制备建立了一个新的技术方法,同时也为其他基因编辑及甚至基因打靶的转基因鸡的制备提供了新的思路和方法。
【学位单位】：河北农业大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2020
【中图分类】：S831
【部分图文】：

ＮＡ的识别切割目前使用最广泛的就??由ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系统改造而来ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系统，通过人工设计ｓｇＲＮＡ，引导Ｃａｓ９蛋白对特??异序列识别并切割，造成ＤＮＡ双链断裂（ｄｏｕｂｌｅ?ｓｔｒａｎｄ?ｂｒｅａｋ，?ＤＳＢ）。ＤＳＢ就会促使细胞启动??ＤＮＡ损伤修复机制：非同源末端连接（ｎｏｎ－ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ?ｅｎｄ?ｊｏｉｎｉｎｇ，?ＮＨＥＪ）［５９１和同源重组修复??（ｈｏｍｏｌｏｇｙ－ｄｉｒｅｃｔｅｄ?ｒｅｐａｉｒ，?ＨＤＲ）＿，从而实现基因序列的插入、缺失、替换，见图１－１。对于??ＳｇＲＮＡ，?ＲＮＡ聚合酶ＩＩＩ识别的Ｕ６或Ｈ１启动子在启动转录时依赖的聚合酶在ＲＮＡ的５＇端需??要Ｇ或ＧＧ，所以目前研宄者常在设计ｓｇＲＮＡ的５＇端无Ｇ或ＧＧ时，合成引物时在ｓｇＲＮＡ的??５＇端加Ｇ或ＧＧ，既可以合成有活性的ｓｇＲＮＡ，又可以提高Ｃａｓ９核酸酶编辑的效率［６｜１。２０１３??年，科学家在哺乳动物细胞中实现了对特定基因的编辑Ｍ，从此这项技术得到了迅速发展，推??动了生命科学多个领域的跨越式发展。??纖?ｆｃＷ＂乂Ｖ?，；??ｉｉ?ｌｉｔｉｉｉｉｉｉｎｎｉｉｉｒ??５?ｉｎｎＴｆｎＴｎＴＴＴｎＴｎ＾ｊ?丨１１??ＯＶＷＴＪＫ?ＤＭＡ?Ｘ?＇?＾??．細＜??ｌ??ｒ?ｉｌｌｌｌｉｌｉｌ??１??ｈｕｂｓ??ＢＢＢＳＥｌｌｉｌＳＩ?—，?ＢＥＳＳｐｉｐｉｌｌ??ｍＢＥ?１！?ｉｌｌｌｌｉ?＿工麵??ＭＥＩＨｌｌ：?ＳＨＩ??图１－１?ＣＰＩＳＲＰ／Ｃａｓ９工作原理??ＦＩＧ．?１－１?Ｈｏｗ?ＣＰＩＳＲＰ／Ｃａｓ９?ｗｏｒｋｓ??１．３．２?ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９?的应用??随着Ｃ

?河北农业大学硕士学位（毕业）论文???２材料方法??２．１仪器材料与实验动物??２．１．１质粒与引物合成??ｐＸ３３０、ｐＥＧＦＰ－Ｎ２?质粒购买自美国?ａｄｄｇｅｎｅ?公司，ｐＭＤ１９－Ｔ?ｖｅｃｔｏｒ?和?ｐＭＤ１９?－Ｔ?ｓｉｍｐｌｅ?ｖｅｃｔｏｒ??载体购自宝日医生物技术（北京）有限公司，ｐＴ７－５ｔｅ／－ｔｒａｃ质粒（图２－１－ａ?）、ｐＣＭＶ－ＮｅｏＲ－ｂｇｈ??质粒（图２－１－ｂ?）由本实验室改造，引物合成、基因测序均由深圳华大基因科技有限公司完成。??掛《ｓ?丨，Ｂｂｓｉ??〇?Ｉ?Ｊ??ａ?ｂ??图２－１质粒结构示意图??ＦＩＧ．?２－１?Ｓｃｈｅｍａｔｉｃ?ｄｉａｇｒａｍ?ｏｆ?ｐｌａｓｍｉｄ?ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ??注：ａ：?ｐＴ７－＾Ｚｗ／－ｔｒａｃ质粒载体结构示意图；ｂ：?ｐＣＭＶ－ＮｅｏＲ－ｂｇｈ质粒载体结构示意图??Ｎｏｔｅ：?ａ：?ｓｃｈｅｍａｔｉｃ?ｄｉａｇｒａｍ?ｏｆ?ｐｌａｓｍｉｄ?ｃａｒｒｉｅｒ?ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ?ｏｆ?ｐｔ７－ｂｂｓｉ－ｔｒａｃ；Ｂ：?ｓｃｈｅｍａｔｉｃ?ｄｉａｇｒａｍ?ｏｆ?ｐｌａｓｍｉｄ?ｃａｒｒｉｅｒ?ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ?ｏｆ?ｐｃｍｖ－ｎｅｏｒ－ｂｇｈ??２．１．２实验试剂及来源??ｄＮＴＰｓ?（２．５ｍ?Ｍｅａｃｈ）、Ｔａｑ?酶、６ＸＤＮＡ?ｌｏａｄｉｎｇ?Ｂｕｆｆｅｒ、Ｅ．ｃｏｌｉ?ＤＨ５ａ感受态细胞、组织?ＤＭＡ??提取试剂盒均购自北京全式金生物技术有限公司；琼脂糖，甘油，胰蛋白胨，琼脂粉，酵母提取??粉，氯化钠，无水乙醇，异丙醇均购自保定赛尔克公司；质粒提取试剂盒购自天根生化科技（北??京）有限公司；胎牛血清、ＤＭＥＭ培养液、Ｍ１９９培

５０°〇水浴１５１１１丨１１，转化入￡．〇〇１丨０１１５〇１感受态细胞，摇菌５〇１１１１＾，提取质粒，方法参考质粒??提取试剂盒：将菌液在超净台中转移到不同的５?ｍＬ无菌离心管中，１２０００?ｒｍｐ离心１?ｍｉｎ，尽量??吸净上清培养液。加入２５０?ｐＬ溶液Ｉ?（预加ＲＮａｓｅＡ），用涡旋震荡机充分涡旋震荡使细菌细胞??重悬。向离心管中加入２５０吣溶液ＩＩ，轻轻上下颠倒几次，使菌液充分裂解，此时混合液由浑??浊变的清澈。加入３５０吣溶液ＩＩＩ，立即上下颠倒充分混匀，出现白色沉淀，１２０００?ｒｍｐ离心１０?ｍｉｎ。??将上清液移入到吸附柱中，室温放置２?ｍｉｎ，?１２０００?ｒｐｍ离心１?ｍｉｎ。倒掉收集管中的废液，吸附??柱重新放回收集管中，向吸附柱中加入７００?ｐＬ漂洗液（预加无水乙醇）１２０００?ｒｐｍ离心１?ｍｉｎ，??倒掉收集管中的废液，１２０００?ｒｐｍ空离心３?ｍｉｎ，室温开口在放置３?ｍｉｎ，使漂洗液去除。吸附柱??放入一个干净的离心管中，向吸附膜中央加入４０ｐＬ预热至６０°Ｃ的ｄｄＨ２０，室温静置５ｍｉｎ。??１２０００?ｒｐｍ离心１?ｍｉｎ，收集质粒溶液，做上标记，－２０°Ｃ保存。后续质粒提取实验操作相同，质??粒命名为ＰＸ３３０－ＥＧＦＰ，其结构功能见图２－２。??
【参考文献】

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本文编号：2887146