利用RNAi技术鉴定SRBSDV在白背飞虱体内增殖的关键因子

发布时间：2020-11-17 06:31

　　 南方水稻黑条矮缩病毒(Southern rice black-streaked dwarf virus,SRBSDV)是呼肠孤病毒科(Reoviridae)斐济病毒属(Fijivirus)的一个暂定种,由介体昆虫白背飞虱(Sogatella furcifera)以持久增殖型方式传播,但不经卵传播。由SRBSDV引发的南方水稻黑条矮缩病在我国南方稻区以及越南稻区等地暴发流行给水稻生产造成了严重的损失。病毒编码的非结构蛋白对于病毒在介体昆虫体内的运动、复制和装配等起着重要作用。SRBSDV编码的P5-1、P6和P9-1蛋白是病毒原质的组分,参与病毒的复制和装配。但是同为病毒原质的组分,P5-1、P6和P9-1各自在病毒原质和病毒复制中起着什么作用还没有明确。RNAi技术是近年来研究基因功能的一个重要技术手段,利用RNAi技术进行植物病毒病的防治已成为重要的手段。因此,本研究拟利用RNAi技术鉴定SRBSDV在白背飞虱体内复制起始的关键基因,为病毒病的防控提供一个高效靶标基因。本实验首先扩增SRBSDV-P5-1N-端1-750 bp基因片段,通过Gateway体系构建原核表达载体,特异性诱导表达目的蛋白条带后注射新西兰大白兔制备多克隆抗体,Western blot和免疫荧光标记技术的检测结果表明,本实验所制备的多克隆抗体能特异性检测SRBSDV侵染水稻和白背飞虱表达的P5-1蛋白,表明本实验所制备P5-1多克隆抗体具有较好的特异性。以SRBSDV病毒原质组分P5-1、P6和P9-1蛋白为研究对象,利用T7转录酶体外合成其双链RNA (double-stand RNA, dsRNA),利用显微注射法将浓度约为0.5 μg/μL的dsRNA导入饲毒2d的白背飞虱体内,同时以注射dsGFP的处理为对照。注射后6d用相关蛋白的荧光抗体进行免疫荧光标记,共聚焦显微镜观察发现,分别干扰P5-1、P6和P9-1基因表达后,均能明显抑制相关基因P5-1、P6、P9-1、P7-1和P10在白背飞虱体内的表达,且病毒被限制在初侵染的中肠上皮细胞中,没有发生扩散。抑制P5-1蛋白表达后,P6和P9-1蛋白仍可表达,但仅限于在初侵染细胞中表达,P7-1和P10蛋白表达受到明显抑制,认为P5-1作为与病毒粒体装配有关的蛋白,其调控着外壳蛋白和扩散相关蛋白的表达,从而阻碍了病毒在白背飞虱体内的装配和扩散。干扰P6蛋白的表达后,84%的昆虫体内检测不到P6蛋白,同时也检测不到P5-1、P9-1、P7-1和P10蛋白,但在16%的昆虫上皮细胞内可检测到P6蛋白,此时也可检测到P5-1、P9-1、P7-1和P10蛋白,表明P6蛋白不表达则不能启动病毒的增殖,一旦P6蛋白有少量的表达则启动病毒在上皮细胞内的增殖。抑制P9-1蛋白的表达后,P6蛋白仍可表达,但也仅局限在初侵染的上皮细胞内,而P5-1蛋白的表达受到抑制,同时P7-1和P10蛋白的表达也受到明显抑制,表明参与病毒基因组复制的P9-1蛋白表达受抑制后,参与病毒装配的P5-1蛋白和外壳蛋白P10的表达受到抑制,同时由于病毒无法装配,使管状结构蛋白P7-1表达受到抑制。此外,本实验通过RT-qPCR检测了dsRNA对病毒增殖的影响,发现干扰P5-1、P6和P9-1基因的表达后,编码病毒外壳蛋白的P10基因拷贝数相对处理组明显下降,表明病毒在白背飞虱体内的复制和增殖受到阻碍。Western blot检测也发现分别抑制P5-1、P6和P9-1蛋白的表达后,能明显抑制其它相关蛋白的表达。其中抑制P5-1蛋白表达后,能检测P6和P9-1蛋白能有少量表达,P10几乎没有表达,干扰P6表达后,均没有检测到相关蛋白的表达；抑制P9-1蛋白表达后,P6蛋白有少量表达,其余相关蛋白均没有检测到。综上所述,本研究通过dsRNA诱导的RNAi技术,明确了P5-1、P6和P9-1均是SRBSDV在昆虫体内增殖的重要蛋白,抑制单个基因的表达均能明显抑制病毒在介体昆虫体内的复制和扩散。P6蛋白在病毒增殖中起最关键的作用,负责启动病毒在初侵染上皮细胞内的增殖,抑制P6蛋白的表达则抑制病毒所有蛋白的表达；P9-1蛋白作为病毒基因组复制的场所,其表达受抑制后则间接调控与病毒装配有关蛋白的不表达：P5-1蛋白作为病毒装配的场所,抑制其表达则调控病毒外壳蛋白及管状结构蛋白P7-1的表达。因此,我们认为P6蛋白是病毒增殖过程中最关键的因子,对病毒原质的形成发挥启动作用,可作为病毒病防控的理想靶标蛋白。
【学位单位】：福建农林大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2015
【中图分类】：S433
【文章目录】：
摘要
Abstract
1 引言
    1.1 南方水稻黑条矮缩病毒的研究进展
        1.1.1 南方水稻黑条矮缩病的发现、分布以及危害
        1.1.2 南方水稻黑条矮缩病的表型症状特点
        1.1.3 南方水稻黑条矮缩病的自然寄主和传播介体
        1.1.4 SRBSDV的病毒学分类地位
        1.1.5 SRBSDV的基因组结构及其功能研究
    1.2 植物呼肠孤病毒复制场所—病毒原质的研究进展
    1.3 植物病毒在介体昆虫体内的侵染循回过程
    1.4 原核表达系统的研究概况以及应用
    1.5 RNAi的发现以及应用
        1.5.1 RNAi的发现
        1.5.2 RNAi的原理
        1.5.3 RNAi技术应用
    1.6 本研究的目的和意义
2 实验材料和方法
    2.1 实验材料
        2.1.1 菌株和载体
        2.1.2 水稻病株和介体昆虫白背飞虱
        2.1.3 实验试剂
        2.1.4 实验主要器材
    2.2 实验方法
        2.2.1 SRBSDV蛋白P5-1抗体的制备
            2.2.1.1 引物的设计和合成
            2.2.1.2 感染SRBSDV的水稻总RNA提取
            2.2.1.3 RT-PCR扩增SRBSDV的基因片段P5-1
            2.2.1.4 纯化回收扩增的SRBSDVP5-1产物
            2.2.1.5 入门载体pDONR221-P5-1的构建
            2.2.1.6 原核表达载体pDEST17-P5-1的构建
            2.2.1.7 原核表达载体pDEST17-P5-1转入Rosetta（DE3）菌株
            2.2.1.8 SRBSDV非结构蛋白P5-1的原核诱导表达
            2.2.1.9 SRBSDV非结构蛋白P5-1抗血清的制备
            2.2.1.10 P5-1抗血清的特异性检测
            2.2.1.11 P5-1抗血清的纯化
            2.2.1.12 抗体交联荧光素
            2.2.1.13 P5-1在SRBSDV侵染的白背飞虱体内的分布
        2.2.2 源于SRBSDV基因片段的dsRNAs对病毒侵染白背飞虱的影响
            2.2.2.1 dsRNA的引物设计和合成
            2.2.2.2 微针注射体外合成的dsRNA
            2.2.2.3 免疫荧光标记检测dsRNAs处理对SRBSDV在白背飞虱体内侵染的影响
            2.2.2.4 RT-qPCR检测体dsRNAs处理对SRBSDV侵染白背飞虱的影响
            2.2.2.5 Western blot检测dsRNAs处理后SRBSDV编码的相关蛋白在白背飞虱体内表达量的变化
3 结果分析
    3.1 SRBSDV非结构蛋白P5-1抗体的制备
        3.1.1 RT-PCR扩增目的片段
        3.1.2 入门载体pDONR221-P5-1的构建
        3.1.3 原核表达载体pDEST17-P5-1的构建
        3.1.4 原核表达载体pDEST17-P5-1转入Rosetta（DE3）菌株
        3.1.5 SRBSDV非结构蛋白P5-1的原核诱导表达
        3.1.6 Western blot检测抗血清的特异性
        3.1.7 P5-1在SRBSDV侵染的白背飞虱体内的分布
    3.2 dsRNAs处理对SRBSDV侵染白背飞虱的影响
        3.2.1 dsRNA的合成
        3.2.2 dsP5-1处理对病毒相关基因在白背飞虱体内的表达的影响
        3.2.3 dsP6处理对病毒相关基因在白背飞虱体内的表达的影响
        3.2.4 dsP9-1处理对病毒相关基因在白背飞虱体内的表达的影响
    3.3 干扰单个基因表达明显抑制病毒在白背飞虱体内的复制
    3.4 dsRNA处理抑制SRBSDV相关基因在蛋白水平上的表达
4 讨论
参考文献
附录
致谢

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