玉米高亲和磷转运体ZmPht1;5的启动子克隆和功能研究

发布时间：2020-11-20 21:22

　　 磷是植物生长发育所需的大量元素,在植物的生命活动中发挥重要作用,磷缺乏将严重影响农业生产。由于作为磷肥主要来源的磷矿石资源的匮乏和趋于耗竭,缺磷已成为未来世界农业生产的一个巨大挑战。利用转基因技术调控磷效率相关基因的表达,培育磷高效作物新品种,可有效地解决上述问题。选择合适的启动子可以促进转基因的有效表达,有利于转基因技术的成功应用。因此,克隆可用于磷效率育种的启动子具有重要意义。ZmPht1;5编码一个高亲和磷转运体蛋白,具有吸收和转运磷的能力以及磷饥饿响应特性,但其启动子序列一直未被克隆和研究,其潜在的调控网络尚不明确。本研究从玉米中克隆了 ZmPht1;5基因ATG上游的1895 bp序列(M2P-1),构建了系列5’端缺失突变体(M2P-2～M2P-8),对其进行了系统的功能鉴定。M2P-1～M2P-8在烟草中的组织表达模式分析表明,其萌发2、7、14和21天的小苗,培养至60天及90天植株的根、茎、叶和生长90天植株的种子、果实和花中均能驱动GUS表达,但它们的表达活性存在明显差异,其中M2P-7(-259 bp～-1 bp)的活性最高,在正常条件下可达到CaMV35S启动子的1.5倍左右,表明M2P-7片段可能是ZmPht1;5高强度表达的关键序列。为了明确启动子PZmPht1;5及其5’端缺失片段的磷饥饿响应能力,我们以WT和CaMV35S转基因烟草分别作为阴性和阳性对照,对15日龄的M2P-1～M2P-8突变体烟草及对照进行了低磷胁迫(10μM KH2PO4)处理实验。GUS染色和酶活测定结果显示,随着植物体内可溶性磷浓度的降低,M2P-1～M2P-8的启动子活性相应增强,而CaMV35S的启动子活性在低磷处理前后无显著差异。值得注意的是在低磷处理至第9天时,M2P-7在根、茎和叶中的启动子活性分别达到了CaMV35S启动子的3.5、4.0和3.3倍。以上结果表明,M2P-7可在低磷条件下驱动目的基因高强度表达,在双子叶作物磷高效转基因育种中具有重要应用价值。为了进一步评估M2P-7在单子叶植物遗传转化中的应用潜质,我们分别将M2P-7和玉米Ubi-1启动子(阳性对照)连入pCAMBIA1391Z载体中,驱动GUS的表达,并导入玉米自交系Qi319中。GUS组织化学染色和酶活测定结果显示,在萌发3天的种子胚根、7天和14天小苗的根、茎和叶中,M2P-7较Ubi-1似乎具有更高的启动子活性。为了明确M2P-7在玉米中是否依然具有磷饥饿响应特性,我们对M2P-7和pCAMBIA1391Z-Ubi-GUS(阳性对照)转基因小苗进行了低磷胁迫(5μM KH2PO4)处理实验。GUS组织化学染色和酶活测定结果显示,在低磷处理至第7天和第10天时M2P-7在玉米根、茎和叶中的表达活性比足磷条件下提高了约1.3倍,而Ubi-1启动子在低磷处理前后无显著差异。值得注意的是,尽管M2P-7在玉米中的磷饥饿诱导能力相对较低,但在低磷条件下M2P-7在所有检测的组织中的启动子活性均显著高于Ubi-1启动子,预示着M2P-7在单子叶植物磷高效育种中也具有很好的应用潜质。总之,本工作通过对ZmPht1;5启动子进行5’系列缺失突变体的构建、组织表达模式及磷饥饿响应特性分析,发现长度为295-bp的M2P-7片段是该启动子的核心功能序列,具有高的启动子活性和一定的低磷诱导特性。在低磷胁迫条件下,M2P-7的启动子活性在烟草中可达到双子叶植物转化中最常用的CaMV35S启动子的3倍以上,在玉米中可达到单子叶作物育种中最常用的玉米Ubi-1启动子的大约1.3倍,在单子叶和双子叶作物磷高效转基因育种中均体现出了很高的应用潜质。上述研究结果不仅可加深我们对ZmPht1;5基因低磷胁迫响应特性及其表达调控机制的了解,而且为作物基因工程育种提供了可供选择的启动子资源。
【学位单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2020
【中图分类】：S513
【部分图文】：

?山东大学硕士学位论文???３．４?Ｍ２Ｐ－１－Ｍ２Ｐ－８转基因本生烟草的获得??将Ｍ２Ｐ－１?￣Ｍ２Ｐ－８质粒以及驱动Ｇｔ／Ｓ表达的质粒（ｐＣＡＭＢＩＡ?１３０４Ｚ；??阳性对照）利用农杆菌介导的叶盘转化法分别转入本生烟草，转化实验流程见图??４。??ａ?ｂ?＇?ｃ??＃ｉ＞；??图４农杆菌介导的烟草叶盘转化流程??ａ，用于转化的本生烟草；ｂ，农杆菌侵染后避光共培养的叶盘；ｃ，在筛选培养基（含１５ｍｇ／Ｌ??潮霉素＋４００?ｍｇ／Ｌ头孢）上筛选：ｄ，抗性愈伤分化生苗：ｅ，小苗移入Ａ５培养基生根；ｆ，??移栽至育苗土的小苗。??ＣＴＡＢ法提取转化烟草植株的叶片基因组ＤＮＡ，利用引物ＧＵＳ－Ｆ／Ｒ?（表１）??进行ＰＣＲ扩增（图５ａ）。ＰＣＲ阳性的植株进一步进行ＧＵＳ染色鉴定（图５ｂ），??两者均为阳性的植株用于收获后代种子。通过潮霉素抗性筛选分离比为３：?１的??Ｔ１代转基因株系再进行后代繁殖（图６）。最后，通过分离比统计选择Ｔ３代单??拷贝纯合转基因品系用于后续功能分析。Ｍ２Ｐ－ＫＭ２Ｐ－８分别获得了?４个以上来??自独立转化事件的转基因纯合株系。因为本实验中来自同一个转化结构的不同纯??合株系间的ＧＯＳ表达水平差异并不明显，所以后续实验我们在每个转化结构中??随机性地挑选了?３个不同的纯合子株系作为实验材料。??３１??

?山东大学硕士学位论文???Ｉｄ，泰??￥?方零？?＊｜＾ｐｒ??Ｎｅｇａｔｉｖｅ?Ｃｏｎｔｒｏｌ?（ＷＴ）?Ｍｅｎｄｅｌｉａｎ?Ｓｅｇｒｅｇａｔｉｏｎ?Ｒａｔｉｏ?３：１?Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ?Ｌｉｎｅ?Ｐｏｓｔｉｖｅ?Ｃｏｎｔｒｏｌ??图６转基因烟草Ｔ１代的单拷贝株系筛选??通过潮霉素抗性筛选分离比为３：?１的Ｔ１代转基因株系。??３．５正常条件下５及其５’端缺失突变体在转基因烟草中的??表达模式??为了明确正常条件下Ｍ２Ｐ－１？Ｍ２Ｐ－８及ＣａＭＦ３５＾启动子在烟草中的表达模??式，我们对萌发２、７、１４和２１天的转基因烟草，生长６０和９０天的植株的根、??茎和叶，以及生长９０天植株的种子、花和果实进行了?ＧＵＳ染色（图７ａ）。ＧＵＳ??染色结果表明，Ｍ２Ｐ－ｌ￣Ｍ２Ｐ－８和启动子均可实现Ｇｔ／Ｓ在转基因烟草??中表达，但它们在ＧＵＳ染色强度上存在较大差异。Ｍ２Ｐ－１?（全长启动子）的ＧＵＳ??染色强度在所有供试组织中最弱，在萌发２、７、１４和２１天的转基因幼苗的叶和??根中几乎无法检测到ＧＵＳ染色。值得注意的是，位于Ｍ２Ｐ－１－Ｍ２Ｐ－７之间的１６００??ｂｐ?（－１８９５—２９５?ｂｐ）片段的缺失导致Ｍ２Ｐ－７植株在各个组织的ＧＵＳ染色强度似??乎高于Ｍ２Ｐ－１？Ｍ２Ｐ－６、Ｍ２Ｐ－８和Ｑ７ＭＢ５Ｓ启动子转基因植株。为了进一步评估??Ｍ２Ｐ１－Ｍ２Ｐ－８和启动子之间表达强度的差异，我们测定了生长６０天??的转基因烟草植株的根、茎和叶中的ＧＵＳ酶活（图７ｂ）。结果显示，随着５’侧??翼片段的不断缩短，缺失突变体的启动子活性逐渐增加，在缩短到２９５ｂｐ（Ｍ２Ｐ－??７）时达到最高，然而在位于Ｍ２Ｐ－７？Ｍ

?山东大学硕士学位论文???果表明，磷饥饿抑制了转基因烟草植株的生长。??ａ?０?ｄ?３?ｄ?６ｄ?９?ｄ??ｎｒｉｍｔ?Ｊ??＇＾３?０．１５??Ｃ?〇．６１??〇．ｇ?－??ｍｍｍｍ?４?Ｐ?Ａ?＋?Ｐ?＋?Ｐ??Ｃ＝３?－?Ｐ?ｒ?ｆｔ?？?＝?－?Ｐ?？＝?＊?Ｐ??０．１２?ｒｈ?０５?！?＝〇６??ｉＥ』ｔ?Ｌ：：』ｌ??ｐ?ｊＦ?２??＾?０Ｊ？??ｚ??０＾７??－?０．４????—Ｐ?％?＋?Ｉ＊?Ｉ?＋?ｐ??－ｌｄ?６ｄ?９ｄ?３ｄ?６ｄ?９ｄ?３ｄ?６ｄ?９ｄ??图８低磷处理对烟草植株磷浓度和生长发育的影响??ａ，转基因烟草植株的表型；ｂ－ｄ，根、地上部分和整个植株的生物量；ｅ，根冠比；ｆ－ｇ，根和??地上部分可溶性磷浓度。测定数据为３次重复的平均值±标准差，每个株系３棵植株，＊代表??低磷处理前后的实验数据达到显著差异水平（Ｐ＜０．０５，?ｆ检验）。??为了明确５及其５’端缺失片段是否对磷饥饿有响应，我们在低磷??处理的第３、６和９天，通过ＧＵＳ组织化学染色和酶活定量分析，测定了?Ｍ２Ｐ－??１－Ｍ２Ｐ－８和启动子（阳性对照）转基因烟草幼苗的根、茎和叶中的ＧＵＳ??活性（图９和图１０）。结果显示，随着转基因植物体内可溶性磷浓度的降低，Ｍ２Ｐ－??ｌ￣Ｍ２Ｐ－８的启动子活性相应增强。在低磷处理至第６天和第９天时，Ｍ２Ｐ－１？Ｍ２Ｐ－??８转基因烟草的ＧＵＳ活性是足磷对照的２倍左右，而启动子在低磷处??理前后的ＧＵＳ活性无明显差异（图１０ｂ？ｃ）。值得注意的是，在缺磷条件下，Ｍ２Ｐ－??３６??
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本文编号：2892013