马铃薯M病毒和马铃薯A病毒单克隆抗体的创制及血清学检测技术
发布时间：2020-12-13 15:48
马铃薯是小麦、水稻和玉米之后的世界第四大粮食作物,但其病毒病严重危害马铃薯作物,并构成重大的产量和经济损失。马铃薯M病毒（Potato virus M,PVM）和马铃薯A病毒（Potato virus A,PVA）是两种重要的马铃薯病毒。目前主要是通过种植脱毒苗和无病毒种薯来防控马铃薯病毒病,而生产脱毒苗和无毒种薯必须要建立快速简便、高效灵敏的病毒检测方法。为此,本论文分别制备出PVM和PVA的单克隆抗体,并以单抗为核心构建了三种血清学检测方法,从而为PVM和PVA检测、脱毒种薯种苗的生产及科学防控体系构建提供技术支持。（1）PVM单克隆抗体的制备及其检测应用:用提纯的PVM病毒粒子免疫BALB/c小鼠,使用杂交瘤技术获得了4株能稳定分泌抗PVM单克隆抗体的杂交瘤细胞株（1E1、2A5、8A1和17G8）。这4株杂交瘤细胞产生的单抗腹水的间接ELISA效价均达到10-7。Western blot分析结果表明4株单抗腹水都与PVM外壳蛋白发生特异性免疫反应。以单抗为核心建立了检测PVM的三种特异性好和灵敏度高的血清学方法,即ACP-ELISA、dot-ELISA和T...
【文章来源】：浙江大学浙江省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：70 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
PVM的基因组结构(引自郑红英等,2003)
浙江大学硕士学位论文1文献综述11体，但体外培养不能长时间存活。骨髓瘤细胞可以在体外培养并能不断繁殖，但是不产生特异性抗体。所以若想要同时具备分泌抗体和无限繁殖特性的细胞，可以利用融合剂，将两种细胞进行融合，得到的杂交瘤细胞就具备这两种特性(黄德青,2019)。细胞融合后，还有大量没有融合的骨髓瘤细胞和同一骨髓瘤细胞融合产物，可以被含氨基喋呤的培养基杀死，使得只有杂交瘤细胞存活(图1.3)(Littlefield,1964;李娜,2015)。图1.3杂交瘤细胞HAT培养基筛选原理Fig1.3ScreeningprincipleofHATmediumforhybridomacells1.3.2.2兔单克隆抗体技术的发展1995年，Spiekerpolet等人首次免疫转基因的兔子，制备出稳定的兔杂交瘤细胞系，使得兔单克隆抗体技术有了很大的突破性进展(Spiekerpoletetal.,1995)。随后兔单克隆抗体在Pytela等人的努力下产量大幅度增加(Pytelaetal.,2008)。与鼠单克隆抗体相比，它具有很多优势。兔单抗可以识别包括小鼠体内无法产生免疫反应的抗原表位；兔抗的亲和力高，且具有更高的灵敏度；同时兔子具有较大的脾脏，能够进行多次免疫融合，有助于高通量筛选出融合细胞(吴建祥,2008;Fengetal.,2011)。现在兔单克隆抗体的制备技术日趋成熟，商品化的单抗数量已有数千种。其在免疫细胞化学和检测蛋白的转译后修饰方面有显著的优势(Huangetal.,1998;Xue.etal.,2001;Taoetal.,2006;)，由于兔单抗人源化更容易使得开发药物前景更广阔(李婷婷等,2012)。迄今为止，用于临床诊断和癌症研究的兔单克隆抗体已经有超过100种(Fletcheretal.,2002;Powelletal.,2007)。
浙江大学硕士学位论文2马铃薯M病毒单克隆抗体的创制及其检测应用18图2.1蛋白质从凝胶转到硝酸纤维素膜示意图Figure2.1Diagramofproteintransferred5)Westernblot转膜结束后，用PBST缓冲液漂洗NC膜，除去膜上转移缓冲液；置于PBST缓冲液(含5%脱脂奶粉)，37℃封闭30min，目的是将非特异性的蛋白结合位点全部封闭；在1:5,000倍稀释PVM单抗中37℃孵育1h；用PBST每3min洗涤1次，共3次；放入1:8,000倍稀释AP标记羊抗鼠IgG二抗中，37℃孵育1h；用PBST洗涤4次，再用PBS洗涤1次；将膜浸入含66μLNBT和33μLBCIP的10mL底物缓冲液中室温遮光反应，约5-20min后特异性条带显色明显时取出膜置于PBS中，终止显色反应；干燥膜后拍照记录。2.1.5血清学方法的建立及其特性分析2.1.5.1ACP-ELISA的建立及其特性分析和应用(一)具体方法步骤：1)包被：将马铃薯的叶片样品充分磨碎后，按1:20(w/v,g/mL)比例加入0.05M碳酸盐缓冲液(pH9.6)并继续匀浆1min，8,000rpm离心3min后取上清得到病毒粗提液。酶标板中每孔加入100μL粗提液，37℃温箱中2h或4℃过夜，包被后用PBST洗涤3次，静置3min/次；2)封闭：每孔加入PBS封闭液(含3%脱脂奶粉)250μL，37℃温箱中0.5h后弃封闭液；
【参考文献】：
期刊论文
[1]一种快速检测水稻条纹病毒的胶体金免疫层析试纸条的研制（英文）[J]. De-qing HUANG,Rui CHEN,Ya-qin WANG,Jian HONG,Xue-ping ZHOU,Jian-xiang WU. Journal of Zhejiang University-Science B（Biomedicine & Biotechnology）. 2019(04)
[2]基于单克隆抗体的检测马铃薯植物中马铃薯S病毒的血清学方法（英文）[J]. Ge SONG,Jia-yu WU,Yan XIE,Yong LIU,Ya-juan QIAN,Xue-ping ZHOU,Jian-xiang WU. Journal of Zhejiang University-Science B（Biomedicine & Biotechnology）. 2017(12)
[3]马铃薯M病毒衣壳蛋白原核表达和多克隆抗体制备[J]. 张春雨,李小宇,万千,夏黎明,王忠伟,王韬远,王永志. 东北农业科学. 2017(03)
[4]马铃薯M病毒生物学特性研究[J]. 张威,白艳菊,文景芝,范国权,高艳玲,吕典秋,申宇,邱彩玲,张抒,袁红梅. 东北农业大学学报. 2017(01)
[5]马铃薯Y病毒单克隆抗体的制备及其检测应用[J]. 宋革,郭玉双,饶黎霞,周雪平,吴建祥. 浙江大学学报(农业与生命科学版). 2016(05)
[6]马铃薯茎尖分生组织培养技术[J]. 王航,刘江娜,陈英. 农村科技. 2014(05)
[7]马铃薯病毒病防治技术研究进展[J]. 苑智华. 安徽农业科学. 2013(25)
[8]马铃薯病毒的常用检测方法[J]. 刘玲玲,韩黎明,张尚智,禹娟红. 中国马铃薯. 2013(04)
[9]宁夏固原地区马铃薯M病毒的检测鉴定[J]. 张永江,刘忠梅,燕照玲,刘洪义,马洁,陈林,辛言言,马云霞. 河南农业科学. 2013(08)
[10]马铃薯A病毒液相芯片快速检测方法的建立[J]. 刘洪义,张永江,刘忠梅,辛言言,李桂芬,张洪祥. 中国农学通报. 2013(15)
博士论文
[1]四种植物病毒单克隆抗体和传染性法氏囊病病毒疫苗研制及应用[D]. 吴建祥.浙江大学 2008
硕士论文
[1]柑橘黄龙病菌和甘薯茎腐病菌单克隆抗体的制备及应用[D]. 黄德青.浙江大学 2019
[2]大麦黄矮病毒GAV株系和小麦黄花叶病毒单克隆抗体的制备及其应用[D]. 李娜.浙江大学 2015
[3]水稻矮缩病毒和水稻黑条矮缩病毒单克隆抗体的制备及其应用[D]. 倪跃群.浙江大学 2013
本文编号：2914790
【文章来源】：浙江大学浙江省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：70 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
PVM的基因组结构(引自郑红英等,2003)
浙江大学硕士学位论文1文献综述11体，但体外培养不能长时间存活。骨髓瘤细胞可以在体外培养并能不断繁殖，但是不产生特异性抗体。所以若想要同时具备分泌抗体和无限繁殖特性的细胞，可以利用融合剂，将两种细胞进行融合，得到的杂交瘤细胞就具备这两种特性(黄德青,2019)。细胞融合后，还有大量没有融合的骨髓瘤细胞和同一骨髓瘤细胞融合产物，可以被含氨基喋呤的培养基杀死，使得只有杂交瘤细胞存活(图1.3)(Littlefield,1964;李娜,2015)。图1.3杂交瘤细胞HAT培养基筛选原理Fig1.3ScreeningprincipleofHATmediumforhybridomacells1.3.2.2兔单克隆抗体技术的发展1995年，Spiekerpolet等人首次免疫转基因的兔子，制备出稳定的兔杂交瘤细胞系，使得兔单克隆抗体技术有了很大的突破性进展(Spiekerpoletetal.,1995)。随后兔单克隆抗体在Pytela等人的努力下产量大幅度增加(Pytelaetal.,2008)。与鼠单克隆抗体相比，它具有很多优势。兔单抗可以识别包括小鼠体内无法产生免疫反应的抗原表位；兔抗的亲和力高，且具有更高的灵敏度；同时兔子具有较大的脾脏，能够进行多次免疫融合，有助于高通量筛选出融合细胞(吴建祥,2008;Fengetal.,2011)。现在兔单克隆抗体的制备技术日趋成熟，商品化的单抗数量已有数千种。其在免疫细胞化学和检测蛋白的转译后修饰方面有显著的优势(Huangetal.,1998;Xue.etal.,2001;Taoetal.,2006;)，由于兔单抗人源化更容易使得开发药物前景更广阔(李婷婷等,2012)。迄今为止，用于临床诊断和癌症研究的兔单克隆抗体已经有超过100种(Fletcheretal.,2002;Powelletal.,2007)。
浙江大学硕士学位论文2马铃薯M病毒单克隆抗体的创制及其检测应用18图2.1蛋白质从凝胶转到硝酸纤维素膜示意图Figure2.1Diagramofproteintransferred5)Westernblot转膜结束后，用PBST缓冲液漂洗NC膜，除去膜上转移缓冲液；置于PBST缓冲液(含5%脱脂奶粉)，37℃封闭30min，目的是将非特异性的蛋白结合位点全部封闭；在1:5,000倍稀释PVM单抗中37℃孵育1h；用PBST每3min洗涤1次，共3次；放入1:8,000倍稀释AP标记羊抗鼠IgG二抗中，37℃孵育1h；用PBST洗涤4次，再用PBS洗涤1次；将膜浸入含66μLNBT和33μLBCIP的10mL底物缓冲液中室温遮光反应，约5-20min后特异性条带显色明显时取出膜置于PBS中，终止显色反应；干燥膜后拍照记录。2.1.5血清学方法的建立及其特性分析2.1.5.1ACP-ELISA的建立及其特性分析和应用(一)具体方法步骤：1)包被：将马铃薯的叶片样品充分磨碎后，按1:20(w/v,g/mL)比例加入0.05M碳酸盐缓冲液(pH9.6)并继续匀浆1min，8,000rpm离心3min后取上清得到病毒粗提液。酶标板中每孔加入100μL粗提液，37℃温箱中2h或4℃过夜，包被后用PBST洗涤3次，静置3min/次；2)封闭：每孔加入PBS封闭液(含3%脱脂奶粉)250μL，37℃温箱中0.5h后弃封闭液；
【参考文献】：
期刊论文
[1]一种快速检测水稻条纹病毒的胶体金免疫层析试纸条的研制（英文）[J]. De-qing HUANG,Rui CHEN,Ya-qin WANG,Jian HONG,Xue-ping ZHOU,Jian-xiang WU. Journal of Zhejiang University-Science B（Biomedicine & Biotechnology）. 2019(04)
[2]基于单克隆抗体的检测马铃薯植物中马铃薯S病毒的血清学方法（英文）[J]. Ge SONG,Jia-yu WU,Yan XIE,Yong LIU,Ya-juan QIAN,Xue-ping ZHOU,Jian-xiang WU. Journal of Zhejiang University-Science B（Biomedicine & Biotechnology）. 2017(12)
[3]马铃薯M病毒衣壳蛋白原核表达和多克隆抗体制备[J]. 张春雨,李小宇,万千,夏黎明,王忠伟,王韬远,王永志. 东北农业科学. 2017(03)
[4]马铃薯M病毒生物学特性研究[J]. 张威,白艳菊,文景芝,范国权,高艳玲,吕典秋,申宇,邱彩玲,张抒,袁红梅. 东北农业大学学报. 2017(01)
[5]马铃薯Y病毒单克隆抗体的制备及其检测应用[J]. 宋革,郭玉双,饶黎霞,周雪平,吴建祥. 浙江大学学报(农业与生命科学版). 2016(05)
[6]马铃薯茎尖分生组织培养技术[J]. 王航,刘江娜,陈英. 农村科技. 2014(05)
[7]马铃薯病毒病防治技术研究进展[J]. 苑智华. 安徽农业科学. 2013(25)
[8]马铃薯病毒的常用检测方法[J]. 刘玲玲,韩黎明,张尚智,禹娟红. 中国马铃薯. 2013(04)
[9]宁夏固原地区马铃薯M病毒的检测鉴定[J]. 张永江,刘忠梅,燕照玲,刘洪义,马洁,陈林,辛言言,马云霞. 河南农业科学. 2013(08)
[10]马铃薯A病毒液相芯片快速检测方法的建立[J]. 刘洪义,张永江,刘忠梅,辛言言,李桂芬,张洪祥. 中国农学通报. 2013(15)
博士论文
[1]四种植物病毒单克隆抗体和传染性法氏囊病病毒疫苗研制及应用[D]. 吴建祥.浙江大学 2008
硕士论文
[1]柑橘黄龙病菌和甘薯茎腐病菌单克隆抗体的制备及应用[D]. 黄德青.浙江大学 2019
[2]大麦黄矮病毒GAV株系和小麦黄花叶病毒单克隆抗体的制备及其应用[D]. 李娜.浙江大学 2015
[3]水稻矮缩病毒和水稻黑条矮缩病毒单克隆抗体的制备及其应用[D]. 倪跃群.浙江大学 2013
本文编号：2914790
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