腐败梭菌胶体金试纸条检测方法的建立及类毒素疫苗的制备和应用

发布时间：2020-12-30 03:31

　　羊快疫（Braxy）是由腐败梭菌引起的急性、致死性传染病。腐败梭菌（Clostridium septicum）是一种革兰氏阳性菌,该菌感染人和家畜引起恶性水肿,因此曾被称为恶性水肿病。羊快疫以发病急、死亡快且感染初期症状不明显为主要特征,对人类健康和畜牧业生产造成严重危害。因此,迫切需要建立一种针对羊快疫等腐败梭菌病的快速诊断方法,以便应用于基层生产,从而做到及时有效防治。同时,疫苗免疫是针对腐败梭菌病有效的预防措施,研发更加有效的疫苗对于此病的防控至关重要。因此本研究根据腐败梭菌生长繁殖特性,发明了一种新型的腐败梭菌培养方法。在此基础上,制备了腐败梭菌多克隆抗体,建立胶体金试纸条检测方法;并制备了腐败梭菌类毒素疫苗,为羊快疫的诊断和防控提供技术支持。研究内容可分为以下三个部分:1、腐败梭菌新型培养方法的建立根据腐败梭菌生长培养需要,设计腐败梭菌培养基,接种腐败梭菌参考株（ATCC12464）,并置于不同气体环境下进行培养,对不同时间下腐败梭菌增菌情况进行OD_600nm测定。最终确定培养基成分和配比,并发现在一定混合气体配比条件下,且pH为7.8时,腐败梭菌菌体培... 

【文章来源】：山东农业大学山东省

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【学位级别】：硕士

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腐败梭菌革（在相同环境条件下：A：腐败梭菌在厌气肉肝汤培养基

腐败梭菌胶体金试纸条检测方法的建立及类毒素疫苗的制备和应用22OD600(A)=1.055；OD600(B)=1.981。结果表明，与传统的厌气肉肝汤培养基相比，自制培养基培养培养腐败梭菌浓度更高，培养效果更好。图1腐败梭菌革兰氏染色镜检图（在相同环境条件下：A：腐败梭菌在厌气肉肝汤培养基中培养的密度；B：腐败梭菌在自制培养基中培养密度）Figure1GramstainingmicroscopicexaminationofC.septicum(A:C.septicuminanaerobicbrothsoupbroth;B:C.septicuminhomemademedia)3.1.2不同培养环境的选择以1%的含量接种本实验室保存的腐败梭菌菌种，A组液体表面以覆盖一层1cm左右厚度的无菌液体石蜡，放置于普通培养箱中，37℃静置培养；B组放置于一定气体比例的厌氧培养箱中，37℃震荡培养。如图2所示，A组在600nm处的吸光度在各时间点上均小于B组，且A组在培养24hOD600达到最高值，而B组在18h时达到最高值。结果表明，相比于完全隔绝空气，一定气体比例的培养环境更有利于腐败梭菌生长。图2腐败梭菌在不同培养环境中的增菌情况(A：完全隔绝空气组；B：混合气体组)Figure2TheproliferationofC.septicumindifferentcultureenvironments(A:completelyisolatedairgroup;B:mixedgasgroup:)3.1.3培养最适pH的摸索培养基分为四组，分别调节培养基pH为7.0、7.4、7.8、8.2，接入等量菌种，放置于相同培养环境中，厌氧培养24h，测定4种培养物在600nm处的吸光度。如图3所示，

山东农业大学硕士学位论文23pH为7.8时，菌液在600nm处的吸光度值最大。由此可知，腐败梭菌在此培养基中的最适pH为7.8。图3腐败梭菌在不同pH中的增菌情况Figure3ProliferationofC.septicumindifferentculureenvironments3.1.4腐败梭菌产毒条件摸索将2.2.1.3中的腐败梭菌培养物各取0.5mL，分别腹腔注射3只昆明小鼠，小鼠的死亡情况如下表所示。结果说明当培养基pH为7.0时，腐败梭菌几乎不产生毒素；在pH为7.8时培养基中毒素含量较高。表5腐败梭菌产毒条件摸索Table5ExplorationoftoxicconditionsofC.septicum3.2腐败梭菌胶体金试纸条的制备3.2.1腐败梭菌菌体蛋白的获取3.2.1.1腐败梭菌菌液PCR鉴定将腐败梭菌进行增菌培养，取少量菌液进行PCR扩增和凝胶电泳鉴定，结果如下图所示,显示出单一的大小为527bp的目的条带。培养基pH值PHoftheculturemedium7.07.47.88.2死亡分数Deathscore0/32/33/33/3死亡时间Timeofdeath-24h6h12h


本文编号：2946899