BCAT4、CYP79F1和ESM1过表达提高西兰花细胞萝卜硫素含量的研究

发布时间：2021-01-10 14:29

　　萝卜硫素（Sulforaphane,SFN）又称莱菔子素,是一种含硫有机化合物,是目前防癌抗癌效果最好的植物天然产物之一,它能诱导机体产生II型解毒酶,使癌细胞程序性凋亡并起到防癌功能。十字花科芸薹属植物西兰花是生产SFN的重要材料,但目前普通西兰花中SFN产量仍无法满足巨大的市场需求,使用成苗作为生产材料会大幅增加生产成本,通过西兰花无菌细胞系生产SFN可缩短生产周期,是一种新型生产方式。之前单一基因改造提高植物SFN含量的策略效果并不理想。本研究从西兰花中克隆了 SFN合成相关的支链氨基酸转移酶4编码基因BCAT4、细胞色素P450氧化酶编码基因CYP79F1和环硫修饰酶编码基因ESM1。分别以单基因导入和三基因串联导入的方式,通过农杆菌法转化西兰花愈伤组织,对所获得的转化细胞系中SFN的含量进行比较,以期获得SFN含量更高的细胞系,为通过细胞系大量培养获取SFN奠定基础。本文主要研究结果如下:1、目的基因克隆:提取西兰花总RNA,并反转录出cDNA;利用ESM1（GenBank No.XM013728577.1）、CYP79F1（GenBank No.MG012890.1）、BC... 

【文章来源】：山西大学山西省

【文章页数】：66 页

【学位级别】：硕士

【图文】：

西兰花RNA凝胶电泳检测

BCAT4、CYP79F1和ESM1过表达提高西兰花细胞萝卜硫素含量的研究22图2.2目的基因PCR扩增M:DNA分子标记;1:基因CYP79F1PCR扩增条带;2:基因ESM1PCR扩增条带;3:基因BCAT4PCR扩增条带Fig.2.2AmplificationoftargetgeneM:DNAMarker;1:AmplificationofgeneCYP79F1;2:AmplificationofgeneESM1;3:AmplificationofgeneBCAT4.2.4.3单基因过表达载体与三基因串联共表达载体的构建为增加青花菜细胞内与萝卜硫素生成有关基因表达水平，通过同源重组的方式构建了基因ESM1、CYP79F1和BCAT4的单基因过表达载体和BCAT4N-SCYP79F1N-SESM1(B-C-E)三基因串联共表达载体。重组质粒T-DNA区域如图1D所示，转化E.coli-DH5α，通过菌液PCR鉴定阳性菌株，通过双酶切对单基因重组质粒进行鉴定，结果如图1A-C所示(BCAT4序列中含EcoR酶切位点，会释放947bp的片段)。测序结果与参考序列比对表明载体构建成功。分别将三个单基因过表达载体作为PCR扩增模板，扩增得到SCYP79F1N、SESM1、BACT4N表达框部分，其中的35S启动子编码序列、Nos3"UTR编码序列、His标签蛋白编码序列和HA标签蛋白编码序列源于载体XF-350，扩增结果如图1E所示，使用同源重组的方式将三个目的基因表达框与载体相连，转化E.coli-DH5α后PCR鉴别阳性菌株，重组质粒使用双酶切进行鉴定，结果如图1F泳道2所示，条带大小正确，测序结果与参考序列比对无误，质粒构建成功。图1F泳道1中条带为双基因重组质粒XF350-BCAT4N-SCYP79F1N双酶切所释放，大小正确，但因测序失败没有启用。

单基因重组载体及三基因串联载体的构建


本文编号：2968875