天女木兰MsGID1同源基因克隆及其在拟南芥中的遗传转化
发布时间：2021-01-16 04:25
天女木兰（Magnolia sieboldii K.Koch）种子具有深度生理休眠特性,给播种育苗造成了一定困扰。基于实验室前期研究结果外源赤霉素处理可有效解除天女木兰种子的休眠,本研究以Illumina高通量测序获得的天女木兰种子转录组数据为参考,从赤霉素信号途径起始受体基因（GIBBERELLIN INSENSITIVE DWARF1,GID1）入手,通过基因克隆,获得MsGID1同源基因。在此基础上,通过实时荧光定量,探究不同温度（4℃和22℃）对MsGID1同源基因在种子吸胀过程中表达模式的影响;探究外源赤霉素（GA3）和多效唑（PAC）浸种低温层积（4℃）过程中MsGID1同源基因的表达模式。利用双酶切方法构建重组过表达载体;并通过农杆菌介导的花序浸染法实现MsGID1同源基因在拟南芥中的遗传转化。为后续基因功能验证奠定基础,也为赤霉素解除种子休眠提供理论依据。主要结果如下:1.差异基因筛选表明GID1为候选基因,通过克隆获得2个天女木兰赤霉素受体基因MsGID1b和MsGID1c,序列全长分别为996 bp、1 032 bp。二者分别编码331和343...
【文章来源】：沈阳农业大学辽宁省
【文章页数】：79 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
图1双子叶植物种子的萌发过程及变化（徐恒恒等，2014）
沈阳农业大学硕士学位论文7研究报道，BR是通过与ABA和GA互作来调控种子萌发（SteberandMcCourt,2001）。BR拮抗ABA对种子萌发产生影响是通过调节MFT（MOTHEROFFTANDTFL1）介导通路，直接抑制ABI5（ABSCISICACIDINSENSITIVE5），产生ABA信号通路的负反馈调节（XiandYu,2010）。此外，BIN2（BRASSINOSTEROIDINSENSITIVE2）是BR信号通路的中心负调控因子，也直接磷酸化并稳定ABI5来缓解ABA对种子萌发的抑制（HuandYu.,2014）。BR与GA互作机制非常复杂，但BR能缓解拟南芥突变体ga1-3和sly1种子萌发的缺陷，表明BR和GA对种子萌发是协同调控（SteberandMcCourt,2001;Lietal.,2018）。同样，施加GA溶液可完全恢复由BR缺失引起的水稻种子发芽率偏低的现象（Lietal.,2020）。（3）细胞分裂素（CTK）和生长素（auxin）在种子萌发中的作用CTK作为植物激素参与种子萌发等一系列生理活动，活跃于萌发的各阶段（Chiwochaetal.,2005）。其通过促进ABA降解（王三根，1999）和减轻胁迫（盐、干旱、重金属和氧化胁迫等）反应来促进种子萌发（Aticietal.,2005;Nikolicetal.,2006;PelegandBlumwald,2011）。植物生长素在维持种子休眠中存在潜在作用，与ABA在种子萌发过程中作用相似（Liuetal.,2013）。在拟南芥种子中，施用生长素可增强ABA抑制作用（Bradyetal.,2003;Liuetal.,2007）。但后来发现低浓度的生长素也可促进种子萌发如蒺藜苜蓿（Medicagotruncatula）和羊草（Leymuschinensis）（刘建利，2010；马红媛等，2008）。图2脱落酸(ABA)和赤霉素(GA)对休眠和萌发的调控模型（Finch-Savageetal.,2006）Fig2Modelfortheregulationofdormancyandgerminationbyabscisicacid(ABA)andgibberellins(GA)(Finch-Savageetal.,2006)
第一章前言10图3赤霉素信号转导途径图谱（Davièreetal.,2016）Fig3PictureofGASignallingPathay（Davièreetal.,2016）1.3本研究目的与意义天女木兰（MagnoliasieboldiiK.Koch）以播种繁殖为主，但因种子具有深度生理休眠特性，导致萌发困难繁殖难度大。前期，课题组开展了关于天女木兰种子的相关研究，如种子休眠原因（李澎等，2006）、萌发过程中的物质代谢（陆秀君等，2009）及内源激素变化（陆秀君等，2014）、差异蛋白质组学（Luetal.,2015;Zhangetal.,2014）和种胚形态解刨观察（梅梅，2015）等研究。此外，课题组还探究了快速打破天女木兰种子休眠的方法。结果发现，GA3浸种后经变温层积或低温层积可以诱导种子内可溶性糖含量升高，促进种胚生长发育，提前完成后熟，提高种子发芽率（陆秀君等,2009）。而且，不同浓度GA3浸种对种子内源激素GA3、ABA等含量存在影响，进而导致催芽效果不同（陆秀君等，2014）。虽然已知道施加外源GA3可有效解除天女木兰种子休眠，但GA3调控天女木兰种子萌发的分子机理尚不清楚。本研究以赤霉素信号通路为切入点，首次克隆天女木兰赤霉素受体基因(MsGID1b和MsGID1c)，对其进行生物信息学分析；探究不同温度（4℃和22℃）浸种对吸胀期二者表达模式的影响；探究低温层积（4℃）过程中，外源赤霉素（GA3）和多效唑（PAC）溶液浸种处理后种子内二者的表达特性；通过构建过表达载体，并遗传转化拟南芥，为该基因功能验证奠定基础，为揭示赤霉素信号通路在天女木兰种子休眠解除过程中的作用机制提供科学依据。
【参考文献】：
期刊论文
[1]不同化学试剂浸种对银杏种子萌发和幼苗生长的影响[J]. 刘振宁,于雯,张倩文,刘蕾,刘颖,高瑛璐. 临沂大学学报. 2019(06)
[2]西天山野生忍冬和蔷薇种子萌发特性研究[J]. 艾克拜尔·毛拉,方紫妍,李林瑜,周龙,陆彪. 河南农业科学. 2019(07)
[3]种子形态生理休眠研究进展[J]. 姚林君,张克亮,熊作明,陶俊. 生态学杂志. 2019(01)
[4]白皮松种子休眠研究进展[J]. 郭聪聪,沈永宝,史锋厚. 南京林业大学学报(自然科学版). 2019(02)
[5]引起核桃种子休眠的主要因素及其休眠类型[J]. 阿卜杜许库尔·牙合甫,古丽尼沙·沙依明尼亚孜,海利力·库尔班,吐逊古丽·托乎提,何丹,加帕尔·卡迪尔. 新疆农业科学. 2017(12)
[6]蚬壳花椒GID1同源基因克隆及其在种子萌发过程中的表达分析[J]. 周韬,王平,孙吉康,李猛. 植物生理学报. 2017(08)
[7]国外林木种子休眠与贮藏的研究进展[J]. 郭欢欢,刘勇,吴成亮,宋协海. 西北林学院学报. 2017(04)
[8]糜子种子生理休眠特性的研究[J]. 陈茜午,杨文耀,刘锦川,王满贵. 北方农业学报. 2017(02)
[9]紫花苜蓿赤霉素受体基因的克隆及表达分析[J]. 陈敏,马琳,贾聪俊,刘希强,龚攀,王赞. 西北植物学报. 2016(11)
[10]GA3和变温层积对天女木兰种子萌发及内源激素的影响[J]. 陆秀君,梅梅,刘月洋,张晓林,马蓓蓓. 西北植物学报. 2014(09)
硕士论文
[1]独脚金内酯对蒙古栎苗木株型的调控作用[D]. 韩晓义.沈阳农业大学 2019
[2]天女木兰种子萌发过程microRNA挖掘及其表达[D]. 魏俊.沈阳农业大学 2017
[3]天女木兰种子萌发过程碳水化合物变化及相关差异蛋白的筛选[D]. 梅梅.沈阳农业大学 2015
[4]天女木兰种子层积过程中物质变化及其与种子萌发的关系[D]. 刘月洋.沈阳农业大学 2010
[5]山芹菜种子休眠特性及萌发生理的研究[D]. 陈姗姗.吉林农业大学 2007
本文编号：2980151
【文章来源】：沈阳农业大学辽宁省
【文章页数】：79 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
图1双子叶植物种子的萌发过程及变化（徐恒恒等，2014）
沈阳农业大学硕士学位论文7研究报道，BR是通过与ABA和GA互作来调控种子萌发（SteberandMcCourt,2001）。BR拮抗ABA对种子萌发产生影响是通过调节MFT（MOTHEROFFTANDTFL1）介导通路，直接抑制ABI5（ABSCISICACIDINSENSITIVE5），产生ABA信号通路的负反馈调节（XiandYu,2010）。此外，BIN2（BRASSINOSTEROIDINSENSITIVE2）是BR信号通路的中心负调控因子，也直接磷酸化并稳定ABI5来缓解ABA对种子萌发的抑制（HuandYu.,2014）。BR与GA互作机制非常复杂，但BR能缓解拟南芥突变体ga1-3和sly1种子萌发的缺陷，表明BR和GA对种子萌发是协同调控（SteberandMcCourt,2001;Lietal.,2018）。同样，施加GA溶液可完全恢复由BR缺失引起的水稻种子发芽率偏低的现象（Lietal.,2020）。（3）细胞分裂素（CTK）和生长素（auxin）在种子萌发中的作用CTK作为植物激素参与种子萌发等一系列生理活动，活跃于萌发的各阶段（Chiwochaetal.,2005）。其通过促进ABA降解（王三根，1999）和减轻胁迫（盐、干旱、重金属和氧化胁迫等）反应来促进种子萌发（Aticietal.,2005;Nikolicetal.,2006;PelegandBlumwald,2011）。植物生长素在维持种子休眠中存在潜在作用，与ABA在种子萌发过程中作用相似（Liuetal.,2013）。在拟南芥种子中，施用生长素可增强ABA抑制作用（Bradyetal.,2003;Liuetal.,2007）。但后来发现低浓度的生长素也可促进种子萌发如蒺藜苜蓿（Medicagotruncatula）和羊草（Leymuschinensis）（刘建利，2010；马红媛等，2008）。图2脱落酸(ABA)和赤霉素(GA)对休眠和萌发的调控模型（Finch-Savageetal.,2006）Fig2Modelfortheregulationofdormancyandgerminationbyabscisicacid(ABA)andgibberellins(GA)(Finch-Savageetal.,2006)
第一章前言10图3赤霉素信号转导途径图谱（Davièreetal.,2016）Fig3PictureofGASignallingPathay（Davièreetal.,2016）1.3本研究目的与意义天女木兰（MagnoliasieboldiiK.Koch）以播种繁殖为主，但因种子具有深度生理休眠特性，导致萌发困难繁殖难度大。前期，课题组开展了关于天女木兰种子的相关研究，如种子休眠原因（李澎等，2006）、萌发过程中的物质代谢（陆秀君等，2009）及内源激素变化（陆秀君等，2014）、差异蛋白质组学（Luetal.,2015;Zhangetal.,2014）和种胚形态解刨观察（梅梅，2015）等研究。此外，课题组还探究了快速打破天女木兰种子休眠的方法。结果发现，GA3浸种后经变温层积或低温层积可以诱导种子内可溶性糖含量升高，促进种胚生长发育，提前完成后熟，提高种子发芽率（陆秀君等,2009）。而且，不同浓度GA3浸种对种子内源激素GA3、ABA等含量存在影响，进而导致催芽效果不同（陆秀君等，2014）。虽然已知道施加外源GA3可有效解除天女木兰种子休眠，但GA3调控天女木兰种子萌发的分子机理尚不清楚。本研究以赤霉素信号通路为切入点，首次克隆天女木兰赤霉素受体基因(MsGID1b和MsGID1c)，对其进行生物信息学分析；探究不同温度（4℃和22℃）浸种对吸胀期二者表达模式的影响；探究低温层积（4℃）过程中，外源赤霉素（GA3）和多效唑（PAC）溶液浸种处理后种子内二者的表达特性；通过构建过表达载体，并遗传转化拟南芥，为该基因功能验证奠定基础，为揭示赤霉素信号通路在天女木兰种子休眠解除过程中的作用机制提供科学依据。
【参考文献】：
期刊论文
[1]不同化学试剂浸种对银杏种子萌发和幼苗生长的影响[J]. 刘振宁,于雯,张倩文,刘蕾,刘颖,高瑛璐. 临沂大学学报. 2019(06)
[2]西天山野生忍冬和蔷薇种子萌发特性研究[J]. 艾克拜尔·毛拉,方紫妍,李林瑜,周龙,陆彪. 河南农业科学. 2019(07)
[3]种子形态生理休眠研究进展[J]. 姚林君,张克亮,熊作明,陶俊. 生态学杂志. 2019(01)
[4]白皮松种子休眠研究进展[J]. 郭聪聪,沈永宝,史锋厚. 南京林业大学学报(自然科学版). 2019(02)
[5]引起核桃种子休眠的主要因素及其休眠类型[J]. 阿卜杜许库尔·牙合甫,古丽尼沙·沙依明尼亚孜,海利力·库尔班,吐逊古丽·托乎提,何丹,加帕尔·卡迪尔. 新疆农业科学. 2017(12)
[6]蚬壳花椒GID1同源基因克隆及其在种子萌发过程中的表达分析[J]. 周韬,王平,孙吉康,李猛. 植物生理学报. 2017(08)
[7]国外林木种子休眠与贮藏的研究进展[J]. 郭欢欢,刘勇,吴成亮,宋协海. 西北林学院学报. 2017(04)
[8]糜子种子生理休眠特性的研究[J]. 陈茜午,杨文耀,刘锦川,王满贵. 北方农业学报. 2017(02)
[9]紫花苜蓿赤霉素受体基因的克隆及表达分析[J]. 陈敏,马琳,贾聪俊,刘希强,龚攀,王赞. 西北植物学报. 2016(11)
[10]GA3和变温层积对天女木兰种子萌发及内源激素的影响[J]. 陆秀君,梅梅,刘月洋,张晓林,马蓓蓓. 西北植物学报. 2014(09)
硕士论文
[1]独脚金内酯对蒙古栎苗木株型的调控作用[D]. 韩晓义.沈阳农业大学 2019
[2]天女木兰种子萌发过程microRNA挖掘及其表达[D]. 魏俊.沈阳农业大学 2017
[3]天女木兰种子萌发过程碳水化合物变化及相关差异蛋白的筛选[D]. 梅梅.沈阳农业大学 2015
[4]天女木兰种子层积过程中物质变化及其与种子萌发的关系[D]. 刘月洋.沈阳农业大学 2010
[5]山芹菜种子休眠特性及萌发生理的研究[D]. 陈姗姗.吉林农业大学 2007
本文编号：2980151
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