SlmiR168a介导的SlAGO1调控番茄低钾胁迫的分子机制研究
发布时间：2021-01-16 04:55
番茄（Solanaceae Lycopersicon Mill）在其发育阶段离不开钾元素的供给,缺钾会严重影响其果实的品质和数量。但现如今我国农田土壤中严重缺少可被吸收利用的钾元素,所以培育耐低钾型的番茄品种是提高番茄吸收钾素效率、适应缺钾土壤的有效方法。课题组前期通过鉴定番茄低钾胁迫下生物量、产量等指标获得了低钾敏感型番茄JZ18和耐低钾型番茄JZ34,通过组学及转基因番茄材料的分析发现miR168a影响低钾胁迫下番茄侧根根毛发育,提高耐低钾性。已有研究表明SlAGO1是番茄miR168a的靶基因。但对于miR168a调控的AGO1参与番茄耐低钾胁迫的分子机制尚不清楚。本研究通过对SlAGO1进行定点突变使之不受miR168a的调控并且不改变其氨基酸序列,构建了35S:mSlAGO1（mutant AGO1）转基因番茄材料。对转基因株系35S:mSlAGO1和miR168a过表达纯合株系（35S:SlmiR168a）的低钾耐性进行了分析。研究结果为深入解析miRNA响应低钾胁迫的分子机制奠定了基础,也可为番茄的耐低钾新品种选育提供新方向。主要研究结果如下:1.RT-PCR检测发现AG...
【文章来源】：沈阳农业大学辽宁省
【文章页数】：59 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
JZ18番茄中AGO1的表达分析
结果与分析22结果与分析3.1SlAGO1在番茄中的组织表达分析提取JZ18番茄各个部位的RNA后反转成cDNA,利用荧光实时定量技术分析SlAGO1基因在JZ18番茄中的组织表达模式，结果表明SlAGO1在番茄中的根茎叶和果实中均有表达，SlAGO1在叶片中表达最高，在果实中表达最少，其表达量在果实的不同时期存在差异，在转色过程中表达量最高，而最低表达量出现在红熟期。图3-1JZ18番茄中AGO1的表达分析图3-1ExpressionanalysisofAGO1inJZ18Tomato3.2mAGO1片段的获得获得JZ18的总RNA，反转录后进行PCR扩增，获得JZ18的AGO1的cDNA序列，进行PCR产物的测序，以此测得序列为基础，根据Sly-MiR168a成熟体结合序列特征，设计针对结合部位序列的碱基突变引物，进行4个碱基突变，丧失miR168a对AGO1的切割功能，但是不影响AGO1的氨基酸序列。图2为miR168与AGO1的互补位点序列，箭头所指的位置为剪切位点。将定点突变的PCR产物进行测序分析，图3-2为定点突变后的测序序列，并发现结合位点突变的4个碱基与预期相同，AGO1为原始序列，mAGO1为突变后序列。图3-2miR168a靶位点碱基突变的序列图Figure3-2SequencediagramofbasemutationofmiR168atargetsiteAGO1mAGO1
沈阳农业大学硕士学位论文233.3过表达载体35S:mSlAGO1的构建设计基因重组的引物序列，对已获得的突变基因mAGO1进行PCR扩增，得到PCR产物，用SmaⅠ和XbaⅠ切割过表达荧光载体，之后利用基因重组酶将PCR产物mAGO1连接到过表达荧光载体pCAMBIA3301/Luc中，mAGO1目的片段长度为3100bp，图3-3为PCR产物mAGO1的目的片段，片段长度符合实验预期结果。图3-3目的片段PCR扩增Figure3-3PCRamplificationofthetargetfragment注：M.DL1kbDNAmarker;1-4,目的片段Note:M.DL1kbDNAmarker;1-4,Purposefragment提取质粒后继续转化农杆菌LBA4404，图3-4为转化后对可能的阳性菌落进行PCR鉴定。图3-435S:mSlAGO1转化农杆菌LBA4404菌液检测电泳图Figure3-4Agarosegelof35S:mSlAGO1inLBA4404注：M.DL1kbDNAmarker;1,水；2，阳性对照；3-8mAGO1基因条带Note:M.DL1kbDNAmarker;1，water；2，Positivecontrol；3-8,mAGO1Purposefragment3.4SlAGO1蛋白的亚细胞定位克隆得到JZ18的cDNA，设计引物扩增SlAGO1的目的片段，片段长度为3100bp，条带显示单一(图3-5)，利用KpnⅠ切割GFP1302载体，在基因重组酶的作用下链接目2500bp5000bp3100bp12345678M2500bp5000bp3100bp1234M
【参考文献】：
期刊论文
[1]miRNA调控植物抗逆机制的研究现状[J]. 李昕晏,崔杰,李俊良,王琮玉,罗成飞. 江苏农业科学. 2019(21)
[2]氮磷钾肥对设施番茄产量与含糖量的影响[J]. 郑新娟,徐柏林. 安徽农业科学. 2019(21)
[3]外源水杨酸对低钾胁迫下百日草幼苗生长的影响[J]. 郭满,朱彦霖,黄文洁,司东霞,李海云. 河南农业科学. 2019(11)
[4]Zm HAK5 and Zm HAK1 function in K+ uptake and distribution in maize under low K+ conditions[J]. Ya-Juan Qin,Wei-Hua Wu,Yi Wang. Journal of Integrative Plant Biology. 2019(06)
[5]低钾胁迫下外源生长素对烟草根系生长及钾吸收的影响[J]. 郭泽,李子绅,代晓燕,王英锋. 植物营养与肥料学报. 2019(07)
[6]拟南芥AGO基因家族分析及盐胁迫下的表达验证[J]. 岳路明,宋剑波,徐晓峰,杨海奇,莫小为,宋军,莫蓓莘. 深圳大学学报(理工版). 2017(04)
[7]大豆microRNA168调控植物低磷胁迫响应[J]. 吕春雨,沙爱华. 中国油料作物学报. 2017(03)
[8]毛竹miR398和miR408的克隆及其表达分析[J]. 李利超,孙化雨,杨意宏,赵韩生,王思宁,高志民. 热带亚热带植物学报. 2017(03)
[9]植物K+通道AKT1的研究进展[J]. 伍国强,水清照,冯瑞军. 植物学报. 2017(02)
[10]低钾胁迫对大豆根系渗透调节物质及产量影响[J]. 邢静,赵凯能,党现什,安俊朋,王晓光,于海秋,赵新华,蒋春姬. 东北农业大学学报. 2016(12)
博士论文
[1]番茄miR1916和miR396在植物响应胁迫中的作用机制[D]. 陈磊.大连理工大学 2018
[2]番茄AGO基因的分离鉴定及SlmiR168、AGO1在番茄生长发育过程中的功能研究[D]. 先志强.重庆大学 2014
硕士论文
[1]miR156及其靶基因SPL9调控植物免疫机制研究[D]. 尹宏标.浙江师范大学 2019
[2]Sly-miR168α调控番茄钾养分吸收和利用的功能验证[D]. 刘杨.沈阳农业大学 2018
[3]盐/干旱胁迫下甜菜幼苗中miR160/164及其靶基因的表达与分析[D]. 孙宗艳.哈尔滨工业大学 2017
[4]MiR398在人参高盐、高铜胁迫中的调控作用[D]. 李躬军.吉林大学 2016
[5]盐芥冷响应miRNA表达模式分析及tsa-miR396功能初探[D]. 熊雪梅.东北林业大学 2014
[6]番茄Sly-miR393的克隆、鉴定及其功能研究[D]. 林冬波.重庆大学 2012
[7]钾对番茄产量及品质的影响[D]. 由天赋.东北农业大学 2002
本文编号：2980191
【文章来源】：沈阳农业大学辽宁省
【文章页数】：59 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
JZ18番茄中AGO1的表达分析
结果与分析22结果与分析3.1SlAGO1在番茄中的组织表达分析提取JZ18番茄各个部位的RNA后反转成cDNA,利用荧光实时定量技术分析SlAGO1基因在JZ18番茄中的组织表达模式，结果表明SlAGO1在番茄中的根茎叶和果实中均有表达，SlAGO1在叶片中表达最高，在果实中表达最少，其表达量在果实的不同时期存在差异，在转色过程中表达量最高，而最低表达量出现在红熟期。图3-1JZ18番茄中AGO1的表达分析图3-1ExpressionanalysisofAGO1inJZ18Tomato3.2mAGO1片段的获得获得JZ18的总RNA，反转录后进行PCR扩增，获得JZ18的AGO1的cDNA序列，进行PCR产物的测序，以此测得序列为基础，根据Sly-MiR168a成熟体结合序列特征，设计针对结合部位序列的碱基突变引物，进行4个碱基突变，丧失miR168a对AGO1的切割功能，但是不影响AGO1的氨基酸序列。图2为miR168与AGO1的互补位点序列，箭头所指的位置为剪切位点。将定点突变的PCR产物进行测序分析，图3-2为定点突变后的测序序列，并发现结合位点突变的4个碱基与预期相同，AGO1为原始序列，mAGO1为突变后序列。图3-2miR168a靶位点碱基突变的序列图Figure3-2SequencediagramofbasemutationofmiR168atargetsiteAGO1mAGO1
沈阳农业大学硕士学位论文233.3过表达载体35S:mSlAGO1的构建设计基因重组的引物序列，对已获得的突变基因mAGO1进行PCR扩增，得到PCR产物，用SmaⅠ和XbaⅠ切割过表达荧光载体，之后利用基因重组酶将PCR产物mAGO1连接到过表达荧光载体pCAMBIA3301/Luc中，mAGO1目的片段长度为3100bp，图3-3为PCR产物mAGO1的目的片段，片段长度符合实验预期结果。图3-3目的片段PCR扩增Figure3-3PCRamplificationofthetargetfragment注：M.DL1kbDNAmarker;1-4,目的片段Note:M.DL1kbDNAmarker;1-4,Purposefragment提取质粒后继续转化农杆菌LBA4404，图3-4为转化后对可能的阳性菌落进行PCR鉴定。图3-435S:mSlAGO1转化农杆菌LBA4404菌液检测电泳图Figure3-4Agarosegelof35S:mSlAGO1inLBA4404注：M.DL1kbDNAmarker;1,水；2，阳性对照；3-8mAGO1基因条带Note:M.DL1kbDNAmarker;1，water；2，Positivecontrol；3-8,mAGO1Purposefragment3.4SlAGO1蛋白的亚细胞定位克隆得到JZ18的cDNA，设计引物扩增SlAGO1的目的片段，片段长度为3100bp，条带显示单一(图3-5)，利用KpnⅠ切割GFP1302载体，在基因重组酶的作用下链接目2500bp5000bp3100bp12345678M2500bp5000bp3100bp1234M
【参考文献】：
期刊论文
[1]miRNA调控植物抗逆机制的研究现状[J]. 李昕晏,崔杰,李俊良,王琮玉,罗成飞. 江苏农业科学. 2019(21)
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[4]Zm HAK5 and Zm HAK1 function in K+ uptake and distribution in maize under low K+ conditions[J]. Ya-Juan Qin,Wei-Hua Wu,Yi Wang. Journal of Integrative Plant Biology. 2019(06)
[5]低钾胁迫下外源生长素对烟草根系生长及钾吸收的影响[J]. 郭泽,李子绅,代晓燕,王英锋. 植物营养与肥料学报. 2019(07)
[6]拟南芥AGO基因家族分析及盐胁迫下的表达验证[J]. 岳路明,宋剑波,徐晓峰,杨海奇,莫小为,宋军,莫蓓莘. 深圳大学学报(理工版). 2017(04)
[7]大豆microRNA168调控植物低磷胁迫响应[J]. 吕春雨,沙爱华. 中国油料作物学报. 2017(03)
[8]毛竹miR398和miR408的克隆及其表达分析[J]. 李利超,孙化雨,杨意宏,赵韩生,王思宁,高志民. 热带亚热带植物学报. 2017(03)
[9]植物K+通道AKT1的研究进展[J]. 伍国强,水清照,冯瑞军. 植物学报. 2017(02)
[10]低钾胁迫对大豆根系渗透调节物质及产量影响[J]. 邢静,赵凯能,党现什,安俊朋,王晓光,于海秋,赵新华,蒋春姬. 东北农业大学学报. 2016(12)
博士论文
[1]番茄miR1916和miR396在植物响应胁迫中的作用机制[D]. 陈磊.大连理工大学 2018
[2]番茄AGO基因的分离鉴定及SlmiR168、AGO1在番茄生长发育过程中的功能研究[D]. 先志强.重庆大学 2014
硕士论文
[1]miR156及其靶基因SPL9调控植物免疫机制研究[D]. 尹宏标.浙江师范大学 2019
[2]Sly-miR168α调控番茄钾养分吸收和利用的功能验证[D]. 刘杨.沈阳农业大学 2018
[3]盐/干旱胁迫下甜菜幼苗中miR160/164及其靶基因的表达与分析[D]. 孙宗艳.哈尔滨工业大学 2017
[4]MiR398在人参高盐、高铜胁迫中的调控作用[D]. 李躬军.吉林大学 2016
[5]盐芥冷响应miRNA表达模式分析及tsa-miR396功能初探[D]. 熊雪梅.东北林业大学 2014
[6]番茄Sly-miR393的克隆、鉴定及其功能研究[D]. 林冬波.重庆大学 2012
[7]钾对番茄产量及品质的影响[D]. 由天赋.东北农业大学 2002
本文编号：2980191
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