链格孢（Alternaria alternata）bHLH转录因子家族基因的克隆及功能研究
发布时间：2021-01-26 00:47
碱性螺旋-环-螺旋（Basic helix-loop-helix,bHLH）转录因子是真核生物中高度保守的一类转录因子,参与调控多种植物致病真菌的分生孢子产生与发育、菌丝形态和致病力等过程。链格孢（Alternaria alternata）侵染烟草引起的赤星病是烟草生产上的一种重要的叶部病害,条件适宜时可引起暴发性危害,导致烟叶品质下降,香气质差,香气量少,刺激性和杂气增加,已成为烟草优质烟叶生产的一大障碍。本研究从链格孢中克隆了bHLH转录因子家族,共得到12个基因,分别命名为AabHLH1AabHLH12。分析发现这12个bHLH转录因子基因编码氨基酸长度差异较大,且同源性很低,但它们都存在一个共同的bHLH结构域,且该结构域位置不固定,有些分布在氨基端,有些分布在中间位置,还有的距离羧基端更近。利用Linear minimum element法和PEG介导的原生质体转化方法获得了AabHLH1AabHLH4的基因插入突变体（M1M4）,并对四个突变体进行了回补。通过对比各突变体与野生菌和回补体之间的差异,进行了Aa...
【文章来源】： 杨然 山东农业大学
【文章页数】：66 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
打靶载体构建示意图
山东农业大学硕士学位论文13因组DNA为模板，扩增4个基因编码区以及自身启动子区域片段。PCR体系和程序与表2、3一致。（2）将四个片段和带有氯嘧磺隆抗性的质粒pCB1532使用SpeI和NotI进行酶切，将酶切产物分别用T4连接酶进行连接，得到回补载体pCB1532-AabHLH（1~4），将得到的回补载体送至生物工程公司进行测序。（3）将测序正确的回补载体转化到4个基因插入突变体的原生质体中，利用250μg·mL-1潮霉素B和5μg·mL-1氯嘧磺隆进行初步筛眩（4）利用反转录PCR，分别以AabHLH（1~4）-CF和AabHLH（1~4）-CR为引物，4个回补体DNA为模板，进行鉴定4个基因的表达。PCR体系和程序与表2、3一致。图2回补体示意图Fig.2Schematicdiagramofcomplement2.2.124个基因插入突变体的生物学表型测定2.2.12.14个基因插入突变体菌落表型观察及生长测定将链格孢野生菌YS-16、4个基因插入突变体（M1、M2、M3、M4）和其回补菌株（C1、C2、C3、C4）活化3~5d后，分别从链格孢野生菌YS-16、4个基因插入突变体和其回补菌株的菌落边缘取直径9mm的菌丝块，接种到PDA和MM培养基上，25℃光照培养箱培养7d，观察菌落形态并测量菌落直径。每个菌株设3个重复，实验重复3次。采用EXCEL记录数据，计算数据的均值及标准差及作图，用SPSS22.0进行方差分析，下同。
链格孢（Alternaria alternata）b HLH 转录因子家族基因的克隆及功能研究 3 结果与分析 3.1 bHLH 转录因子家族 12 个基因的克隆及分析 3.1.1 bHLH 转录因子家族 12 个基因的克隆 分别以链格孢菌野生型菌株 YS-16 的 DNA 和 RNA 为模板，以表 1 所示序列为引物，对其 bHLH 转录因子家族 12 个基因进行扩增，结果如图 3 所示。 1 2 3 4 5 6 7M 8à@J 9 10 6 11 6 12 6
本文编号：3000184
【文章来源】： 杨然 山东农业大学
【文章页数】：66 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
打靶载体构建示意图
山东农业大学硕士学位论文13因组DNA为模板，扩增4个基因编码区以及自身启动子区域片段。PCR体系和程序与表2、3一致。（2）将四个片段和带有氯嘧磺隆抗性的质粒pCB1532使用SpeI和NotI进行酶切，将酶切产物分别用T4连接酶进行连接，得到回补载体pCB1532-AabHLH（1~4），将得到的回补载体送至生物工程公司进行测序。（3）将测序正确的回补载体转化到4个基因插入突变体的原生质体中，利用250μg·mL-1潮霉素B和5μg·mL-1氯嘧磺隆进行初步筛眩（4）利用反转录PCR，分别以AabHLH（1~4）-CF和AabHLH（1~4）-CR为引物，4个回补体DNA为模板，进行鉴定4个基因的表达。PCR体系和程序与表2、3一致。图2回补体示意图Fig.2Schematicdiagramofcomplement2.2.124个基因插入突变体的生物学表型测定2.2.12.14个基因插入突变体菌落表型观察及生长测定将链格孢野生菌YS-16、4个基因插入突变体（M1、M2、M3、M4）和其回补菌株（C1、C2、C3、C4）活化3~5d后，分别从链格孢野生菌YS-16、4个基因插入突变体和其回补菌株的菌落边缘取直径9mm的菌丝块，接种到PDA和MM培养基上，25℃光照培养箱培养7d，观察菌落形态并测量菌落直径。每个菌株设3个重复，实验重复3次。采用EXCEL记录数据，计算数据的均值及标准差及作图，用SPSS22.0进行方差分析，下同。
链格孢（Alternaria alternata）b HLH 转录因子家族基因的克隆及功能研究 3 结果与分析 3.1 bHLH 转录因子家族 12 个基因的克隆及分析 3.1.1 bHLH 转录因子家族 12 个基因的克隆 分别以链格孢菌野生型菌株 YS-16 的 DNA 和 RNA 为模板，以表 1 所示序列为引物，对其 bHLH 转录因子家族 12 个基因进行扩增，结果如图 3 所示。 1 2 3 4 5 6 7M 8à@J 9 10 6 11 6 12 6
本文编号：3000184
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