鸭圆环病毒在人工感染雏鸭体内的侵染分布、组织病理学观察及其致凋亡作用的研究

发布时间：2021-02-27 14:14

　　鸭圆环病毒（Duck circovirus, DuCV）是目前发现的最小的鸭病毒,DuCV感染后可造成鸭生长迟缓,体重下降等症状。迄今为止,对DuCV的致病机制仍不完全清楚,圆环病毒感染通常与淋巴组织损伤有关,并且可以引起宿主淋巴细胞凋亡。因此,研究鸭圆环病毒在人工感染雏鸭体内的侵染分布、组织病理学观察及其致凋亡作用对DuCV致病机制探讨具有十分重要的科学意义。1.实时荧光定量PCR检测鸭圆环病毒方法的建立及半数感染量的确定为定量检测DuCV在感染鸭体内侵染分布的研究,根据NCBI最新公布的所有DuCV序列,比对找出保守区并设计引物,构建包含rep目的基因片段的标准质粒,成功建立特异、敏感的检测DuCV-rep基因的qPCR方法。该建立的qPCR法检测鸭疫里默氏杆菌、致病性大肠杆菌等的基因组模板均无交叉反应,对DuCV特异性反应良好,并且最高检测灵敏度达9.23×101copies/μL,每个梯度之间Cq值标准偏差（SD）在0.16-0.30之间,变异系数（CV）在0.79-1.64之间,重复性良好。此外,通过制备DuCV阳性病料悬液,并对病悬液进行病毒的绝对定量,然后用不同病毒拷贝数... 

【文章来源】：四川农业大学四川省 211工程院校

【文章页数】：80 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
中文摘要
Abstract
符号说明
第一部分 文献综述
    第一章 鸭圆环病毒致病性研究进展
        1 发现及病原学
        2 检测方法
        3 致病机制
        4 小结
第二部分 试验研究
    第二章 实时荧光定量PCR检测鸭圆环病毒方法的建立及半数感染量的确定
        1 材料
            1.1 病料及毒株来源
            1.2 主要试剂及相关配制试剂
            1.3 主要仪器
        2 方法
            2.1 qPCR标准质粒的构建
                2.1.1 引物设计
                2.1.2 qPCR标准质粒目的片段的扩增
                2.1.3 扩增产物的纯化及其与载体的连接
                2.1.4 感受态细胞的制备
                2.1.5 连接产物转化感受态细胞
                2.1.6 阳性重组质粒的鉴定及浓度测定
            2.2 DuCV特异性qPCR方法的建立
                2.2.1 qPCR的引物设计
                2.2.2 qPCR反应退火温度的优化
                2.2.3 标准曲线的建立
                2.2.4 qPCR方法的敏感性试验
                2.2.5 qPCR方法的特异性试验
                2.2.6 qPCR方法的重复性试验
            2.3 DuCV半数感染量的测定
        3 结果
            3.1 标准质粒pEASY-T1-rep的构建
                3.1.1 标准质粒中Rep全长片段的扩增
                3.1.2 菌落PCR鉴定
                3.1.3 重组质粒pEASY-T1-rep酶切鉴定
                3.1.4 重组质粒pEASY-T1-rep测序分析
            3.2 DuCV特异性qPCR方法的建立
                3.2.1 qPCR反应退火温度的优化
                3.2.2 标准曲线的建立
                3.2.3 qPCR方法的敏感性试验
                3.2.4 qPCR方法的特异性试验
                3.2.5 qPCR方法的重复性试验
            3.3 DuCV半数感染量的测定
        4 讨论
            4.1 DuCV特异性qPCR检测方法的建立
            4.2 DuCV半数感染量的测定
        5 小结
    第三章 荧光定量分析鸭圆环病毒在人工感染雏鸭体内的侵染分布及组织病理学观察的研究
        1 材料
            1.1 毒株
            1.2 试验动物
            1.3 主要试剂及相关配制试剂
            1.4 主要仪器
        2 方法
            2.1 DuCV人工感染雏鸭及样本采集
                2.1.1 样品的处理
            2.2 雏鸭人工感染DuCV疾病模型的临床症状
            2.3 雏鸭人工感染DuCV疾病模型的剖检观察
            2.4 雏鸭人工感染DuCV疾病模型的组织病理学观察
                2.4.1 载玻片和盖玻片的处理
                2.4.2 雏鸭人工感染DuCV疾病模型的组织病理学观察
            2.5 qPCR方法检测DuCV在人工感染雏鸭后体内的分布
        3 结果
            3.1 雏鸭人工感染DuCV疾病模型的临床症状
            3.2 雏鸭人工感染DuCV疾病模型的剖检观察
            3.3 雏鸭人工感染DuCV疾病模型的组织病理学观察
                3.3.1 胸腺
                3.3.2 脾脏
                3.3.3 法氏囊
                3.3.4 肝脏
                3.3.5 肾脏
            3.4 qPCR法检测各组织器官DuCV的动态分布变化
                3.4.1 DuCV在接种鸭免疫器官中的动态分布
                3.4.2 DuCV在接种鸭消化器官中的动态分布
                3.4.3 DuCV在接种鸭消化道中的动态分布
                3.4.4 DuCV在接种鸭呼吸道中的动态分布
                3.4.5 DuCV在接种鸭其他组织器官中的动态分布
        4 讨论
            4.1 雏鸭人工感染DuCV疾病模型的病理学检测
            4.2 qPCR法检测人工感染DuCV在雏鸭各组织器官的分布
        5 小结
    第四章 人工感染鸭圆环病毒致雏鸭免疫器官细胞凋亡的动态研究
        1 材料
            1.1 毒株
            1.2 试验动物
            1.3 主要试剂及配制
            1.4 主要仪器及设备
        2 方法
            2.1 人工感染试验
            2.2 兔抗鸭圆环病毒Cap蛋白IgG的纯化
            2.3 免疫组化法检测组织中DuCV抗原的分布变化
                2.3.1 两步法免疫组化法条件优化
                2.3.2 特异性试验
                2.3.3 免疫组化试验
            2.4 TUNEL法检测组织切片细胞凋亡
        3 结果
            3.1 免疫组化法条件优化
            3.2 特异性试验
            3.3 免疫组化法检测组织中DuCV抗原的分布变化
            3.4 人工感染雏鸭后不同组织的动态凋亡变化
        4 讨论
        5 小结
参考文献
致谢
附录
作者简介
攻读硕士学位期间发表的学术论文


【参考文献】：
期刊论文
[1]鸭圆环病毒巢式PCR检测方法的建立及应用[J]. 柴顺秀.  中国畜牧兽医. 2013(06)
[2]鸭圆环病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立[J]. 赵光远,谢芝勋,谢丽基,庞耀珊,邓显文,刘加波,范晴.  畜牧与兽医. 2013(01)
[3]Epidemiological Investigation and Genome Analysis of Duck Circovirus in Southern China[J]. Chun-he Wan,Guang-hua Fu,Shao-hua Shi,Long-fei Cheng,Hong-mei Chen,Chun-xiang Peng,Su Lin and Yu Huang (Institute of Animal Husbandry and Veterinary Medicine,Fujian Academy of Agricultural Sciences,Fuzhou 350013,China).  Virologica Sinica. 2011(05)
[4]鸭圆环病毒抗体的间接ELISA检测方法的建立[J]. 苏小东,曹瑞兵,张羽,刘文娟,陈昊,祝长青,陈溥言.  南京农业大学学报. 2011(05)
[5]鸭圆环病毒套式PCR检测方法的建立[J]. 蔡锐,张小飞,潘玲,胡来根,毛火云,尹秀凤,黄显明.  中国畜牧兽医. 2010(07)
[6]1例雏鸭肝炎病毒和鸭圆环病毒混合感染的诊治[J]. 李威,李学奇,何金箭.  畜牧与兽医. 2008(11)
[7]PCR Detection and Sequence Analysis of Duck Circovirus in Sick Muscovy Ducks[J]. Shi-jin JIANG 1, Xing-xiao ZHANG 1, Shao-ning LIU 1, Yu WANG 2, Yi-bo KONG 1, Xiu-li WEI1, Ya-ni SUN1 and Qin ZHAO1 (1. College of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Agricultural University, Tai’an, 271018, China; 2. Department of Basic Medical Sciences, Taishan Medical College, Tai’an, 271000 ,China).  Virologica Sinica. 2008(04)

硕士论文
[1]鸭圆环病毒ORF3基因的序列分析及基因表达[D]. 魏宗.山东农业大学 2011
[2]鸭圆环病毒的流行病学调查[D]. 刘少宁.山东农业大学 2009



本文编号：3054350