藏绵羊PGAM1和TPI1基因的克隆及在睾丸和附睾组织中的表达
发布时间：2021-03-20 05:19
哺乳动物精子发生是一个复杂而精密的过程,由很多基因参与调控,对雄性动物的繁殖性能具有重要影响。磷酸甘油酸变位酶1（phosphoglycerate mutase 1,PGAM1）和磷酸丙糖异构酶1（triosephosphate isomerase 1,TPI1）是糖酵解代谢过程中的关键酶。睾丸支持细胞可通过糖酵解途径为生精细胞的发育提供能量底物。因而探究PGAM1和TPI1基因在雄性藏绵羊生殖器官中的表达及生物学功能对深入理解其调控机制具有重要的意义。本实验以性成熟前（3月龄）、性成熟（1岁）和成年（3岁）3个较为关键发育期的雄性藏绵羊生殖器官作为试验材料,克隆了PGAM1和TPI1基因的完整CDS区序列,进行生物信息学分析;采用qRT-PCR和Western blot方法从转录和翻译水平检测了藏绵羊生殖器官中PGAM1和TPI1 mRNA和蛋白表达量,运用免疫组织化学染色法检测PGAM1和TPI1蛋白在不同年龄藏绵羊睾丸和附睾组织内表达定位,初步探究了PGAM1和TPI1对雄性藏绵羊生殖器官中的影响。主要研究结果如下:1.藏绵羊PGAM1基因CDS区全长为765 bp,可编码254...
【文章来源】：甘肃农业大学甘肃省
【文章页数】：63 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
哺乳动物睾丸支持细胞糖酵解代谢通路Figure1-1GlycolysispathwayintesticularSertolicellsofmammals
，PTU）诱导的甲状腺功能减退症的小鼠睾丸中，葡糖糖的摄入量，GLUT3和GLUT8的表达量，LDH的活性及睾丸内乳酸的浓度均明显降低，生殖细胞的凋亡率增加，增殖率降低。说明患甲状腺功能减退症的性成熟前小鼠睾丸内通过增加氧化应激（抑制糖酵解过程）来影响生殖细胞的存活和增殖。Verma和Krishna[31]的研究结果表明，由来曲唑诱导的小鼠睾丸中E浓度的下降可能导致胰岛素受体（Insulinreceptor，IR）表达水平下降，进而降低了睾丸内葡萄糖的转运速度，经糖酵解产生的乳酸量降低，细胞的增殖率和存活率下降，凋亡率增加。图1-2差异表达蛋白的KEGG富集结果Figure1-2ResultsofKEGGenrichmentofthedifferentiallyexpressedproteins2磷酸甘油酸变位酶2.1磷酸甘油酸变位酶糖酵解是生物体中糖氧化分解三大途径之一。糖酵解通过多种催化酶（醛缩
藏绵羊PGAM1和TPI1基因的克隆及在雄性生殖器官中的表达13软件进行核苷酸和氨基酸序列同源性比对分析。利用MEGA7.0软件绘制系统发生树，其中氨基酸比对及进化树构建中各物种氨基酸序列均来自NCBI数据库。2结果与分析2.1PGAM1和TPI1基因PCR扩增结果藏绵羊PGAM1和TPI1基因的RT-PCR扩增产物经1%的琼脂糖凝胶电泳检测，获得了与预期扩增片段大小相符的特异性目的片段(图2-1)。克隆得到了片段长度分别为765bp和861bp的核苷酸序列。图2-1PGAM1和TPI1基因的PCR检测结果Figure2-1PCRamplificationofPGAM1andTPI1geneM:DNALadder2000Marker(5μL);1~2:PGAM1；3~4:TPI12.2生物信息学分析经Blast比对发现，PGAM1与用于设计克隆引物的序列的相似度为99.74%（第132位碱基T→G，第708位碱基A→G）（图2-2）；TPI1与用于设计克隆引物的序列的相似度为99.88%（第833位碱基C→T）（图2-3），且均为同义突变。通过NCBI数据库中的ORFFinder在线软件分析发现，在PGAM1克隆序列中存在一个最长的ORF区（1-765bp）；藏绵羊PGAM1基因的CDS区全长为765bp，编码254个氨基酸（起始密码子为ATG，终止密码子为TGA）；TPI1基因
【参考文献】：
期刊论文
[1]种公猪精液质量影响因素分析[J]. 迟兰,谢志诚. 现代牧业. 2020(01)
[2]大动物精原干细胞研究进展[J]. 赵鑫,杨化强. 遗传. 2019(08)
[3]支持细胞对精原干细胞增殖、分化调控的研究进展[J]. 王烁程,陈晓丽,张林波,王栋. 畜牧兽医学报. 2019(02)
[4]山羊钴胺素转运蛋白受体基因CD320的克隆与表达模式[J]. 窦露,王炜,董小龙,刘太行,高静,赵永聚. 农业生物技术学报. 2018(08)
[5]羊繁殖障碍性疾病的发生原因与控制策略[J]. 许峰,焦文强,徐引弟,张青娴,朱文豪,李海利,方剑玉,张立宪,郎利敏,娄治国,王克领,王治方. 上海畜牧兽医通讯. 2018(04)
[6]Dazl基因在绵羊不同发育期睾丸组织中的表达与细胞定位[J]. 李讨讨,马友记,赵兴绪,高建锋,雒瑞瑞,陈灿灿,李东红. 农业生物技术学报. 2018(03)
[7]非编码RNA对哺乳动物精子发生过程的调控[J]. 陈瑞,于帅,陈晓旭,杜健,朱振东,潘传英,曾文先. 中国农业科学. 2017(02)
[8]磷酸甘油酸变位酶1在生精功能障碍睾丸组织中的表达及意义[J]. 张守波,赵元淑,雷斌,孔欣,王彩霞,张娟辉. 实用医学杂志. 2016(24)
[9]基因敲除技术在精子发生相关基因功能研究中的应用[J]. 丁小举,王朝亮,张卫星,王瑞. 中华男科学杂志. 2014(09)
[10]精原干细胞移植相关技术研究进展[J]. 刘玲,朱化彬,王琛,郝海生,赵学明,冯荣,杜卫华,秦彤,刘岩,王栋. 畜牧兽医学报. 2012(11)
博士论文
[1]LIN28A促进奶山羊精原干细胞自我更新和增殖的机制[D]. 马方琳.西北农林科技大学 2019
[2]PGAM1与睾丸生精功能的关系及其生物学功能研究[D]. 张守波.南方医科大学 2016
[3]Y染色体遗传变异及其与公牛繁殖性能的关系研究[D]. 乐祥鹏.西北农林科技大学 2014
硕士论文
[1]永生化绵羊附睾上皮细胞系的建立及其生物学特性分析[D]. 宋慧子.内蒙古农业大学 2019
[2]Dmrt1/7和Boule/Dazl在绵羊睾丸中的表达与定位[D]. 李讨讨.甘肃农业大学 2018
[3]高脂摄入增加大鼠睾丸支持细胞糖酵解和乳酸合成[D]. 罗丹丹.山东大学 2018
[4]PNPLA5基因对雄性大鼠繁殖性能的影响及可能的分子机制研究[D]. 胡言青.中国农业科学院 2018
[5]松墨天牛磷酸丙糖异构酶基因的克隆及表达分析[D]. 吴华俊.华南农业大学 2016
[6]模拟海拔5000米低氧下HIF-1α在小鼠睾丸组织中的表达及其对性激素水平、生精细胞凋亡的影响[D]. 陈香梅.北京协和医学院 2013
[7]捻转血矛线虫磷酸丙糖异构酶基因克隆、表达、酶活性分析及重组谷氨酸脱氢酶活性测定[D]. 苏会敏.南京农业大学 2010
本文编号：3090486
【文章来源】：甘肃农业大学甘肃省
【文章页数】：63 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
哺乳动物睾丸支持细胞糖酵解代谢通路Figure1-1GlycolysispathwayintesticularSertolicellsofmammals
，PTU）诱导的甲状腺功能减退症的小鼠睾丸中，葡糖糖的摄入量，GLUT3和GLUT8的表达量，LDH的活性及睾丸内乳酸的浓度均明显降低，生殖细胞的凋亡率增加，增殖率降低。说明患甲状腺功能减退症的性成熟前小鼠睾丸内通过增加氧化应激（抑制糖酵解过程）来影响生殖细胞的存活和增殖。Verma和Krishna[31]的研究结果表明，由来曲唑诱导的小鼠睾丸中E浓度的下降可能导致胰岛素受体（Insulinreceptor，IR）表达水平下降，进而降低了睾丸内葡萄糖的转运速度，经糖酵解产生的乳酸量降低，细胞的增殖率和存活率下降，凋亡率增加。图1-2差异表达蛋白的KEGG富集结果Figure1-2ResultsofKEGGenrichmentofthedifferentiallyexpressedproteins2磷酸甘油酸变位酶2.1磷酸甘油酸变位酶糖酵解是生物体中糖氧化分解三大途径之一。糖酵解通过多种催化酶（醛缩
藏绵羊PGAM1和TPI1基因的克隆及在雄性生殖器官中的表达13软件进行核苷酸和氨基酸序列同源性比对分析。利用MEGA7.0软件绘制系统发生树，其中氨基酸比对及进化树构建中各物种氨基酸序列均来自NCBI数据库。2结果与分析2.1PGAM1和TPI1基因PCR扩增结果藏绵羊PGAM1和TPI1基因的RT-PCR扩增产物经1%的琼脂糖凝胶电泳检测，获得了与预期扩增片段大小相符的特异性目的片段(图2-1)。克隆得到了片段长度分别为765bp和861bp的核苷酸序列。图2-1PGAM1和TPI1基因的PCR检测结果Figure2-1PCRamplificationofPGAM1andTPI1geneM:DNALadder2000Marker(5μL);1~2:PGAM1；3~4:TPI12.2生物信息学分析经Blast比对发现，PGAM1与用于设计克隆引物的序列的相似度为99.74%（第132位碱基T→G，第708位碱基A→G）（图2-2）；TPI1与用于设计克隆引物的序列的相似度为99.88%（第833位碱基C→T）（图2-3），且均为同义突变。通过NCBI数据库中的ORFFinder在线软件分析发现，在PGAM1克隆序列中存在一个最长的ORF区（1-765bp）；藏绵羊PGAM1基因的CDS区全长为765bp，编码254个氨基酸（起始密码子为ATG，终止密码子为TGA）；TPI1基因
【参考文献】：
期刊论文
[1]种公猪精液质量影响因素分析[J]. 迟兰,谢志诚. 现代牧业. 2020(01)
[2]大动物精原干细胞研究进展[J]. 赵鑫,杨化强. 遗传. 2019(08)
[3]支持细胞对精原干细胞增殖、分化调控的研究进展[J]. 王烁程,陈晓丽,张林波,王栋. 畜牧兽医学报. 2019(02)
[4]山羊钴胺素转运蛋白受体基因CD320的克隆与表达模式[J]. 窦露,王炜,董小龙,刘太行,高静,赵永聚. 农业生物技术学报. 2018(08)
[5]羊繁殖障碍性疾病的发生原因与控制策略[J]. 许峰,焦文强,徐引弟,张青娴,朱文豪,李海利,方剑玉,张立宪,郎利敏,娄治国,王克领,王治方. 上海畜牧兽医通讯. 2018(04)
[6]Dazl基因在绵羊不同发育期睾丸组织中的表达与细胞定位[J]. 李讨讨,马友记,赵兴绪,高建锋,雒瑞瑞,陈灿灿,李东红. 农业生物技术学报. 2018(03)
[7]非编码RNA对哺乳动物精子发生过程的调控[J]. 陈瑞,于帅,陈晓旭,杜健,朱振东,潘传英,曾文先. 中国农业科学. 2017(02)
[8]磷酸甘油酸变位酶1在生精功能障碍睾丸组织中的表达及意义[J]. 张守波,赵元淑,雷斌,孔欣,王彩霞,张娟辉. 实用医学杂志. 2016(24)
[9]基因敲除技术在精子发生相关基因功能研究中的应用[J]. 丁小举,王朝亮,张卫星,王瑞. 中华男科学杂志. 2014(09)
[10]精原干细胞移植相关技术研究进展[J]. 刘玲,朱化彬,王琛,郝海生,赵学明,冯荣,杜卫华,秦彤,刘岩,王栋. 畜牧兽医学报. 2012(11)
博士论文
[1]LIN28A促进奶山羊精原干细胞自我更新和增殖的机制[D]. 马方琳.西北农林科技大学 2019
[2]PGAM1与睾丸生精功能的关系及其生物学功能研究[D]. 张守波.南方医科大学 2016
[3]Y染色体遗传变异及其与公牛繁殖性能的关系研究[D]. 乐祥鹏.西北农林科技大学 2014
硕士论文
[1]永生化绵羊附睾上皮细胞系的建立及其生物学特性分析[D]. 宋慧子.内蒙古农业大学 2019
[2]Dmrt1/7和Boule/Dazl在绵羊睾丸中的表达与定位[D]. 李讨讨.甘肃农业大学 2018
[3]高脂摄入增加大鼠睾丸支持细胞糖酵解和乳酸合成[D]. 罗丹丹.山东大学 2018
[4]PNPLA5基因对雄性大鼠繁殖性能的影响及可能的分子机制研究[D]. 胡言青.中国农业科学院 2018
[5]松墨天牛磷酸丙糖异构酶基因的克隆及表达分析[D]. 吴华俊.华南农业大学 2016
[6]模拟海拔5000米低氧下HIF-1α在小鼠睾丸组织中的表达及其对性激素水平、生精细胞凋亡的影响[D]. 陈香梅.北京协和医学院 2013
[7]捻转血矛线虫磷酸丙糖异构酶基因克隆、表达、酶活性分析及重组谷氨酸脱氢酶活性测定[D]. 苏会敏.南京农业大学 2010
本文编号：3090486
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