小地老虎V-ATP酶A、B亚基的克隆及B亚基昆虫杆状病毒沉默载体构建的研究

发布时间：2021-04-06 13:02

　　采用RNAi技术进行害虫防治是一种全新的害虫防治策略。V-ATP酶是昆虫体内与能量转运有关的H+质子泵,是维持昆虫生命体征的关键蛋白。本研究中首先对小地老虎V-ATP酶的A、B亚基进行了全长c DNA克隆,然后以B亚基为靶基因,构建了沉默B亚基基因的杆状病毒载体,具体结果如下:（1）采用RACE技术克隆了小地老虎V-ATP酶A亚基和B亚基的基因全长,并对基因进行了分析。A亚基基因全长2693bp,其中CDS区1851bp,翻译616个氨基酸,蛋白的分子量为68.06KD;B亚基2583bp,其中CDS区1491bp,编码496个氨基酸,蛋白的分子量为50.01KD。目前,这两个基因已提交至基因库中,并获得基因登录号（A亚基:KM434187;B亚基:KM434188）。（2）根据V-ATP酶B亚基基因序列,设计并合成了3条si RNA,注射到小地老虎3龄幼虫后进行q-PCR检测。选取干扰效果最好的si1（干扰效率44.90%）进行后续的载体构建。（3）转染sf21细胞系,将小鼠U6启动子和B亚基sh RNA构建到昆虫杆状病毒载体p Bac PAK9中,筛选出对小地老虎V-ATP酶具有特... 

【文章来源】：西北农林科技大学陕西省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校

【文章页数】：78 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
第一章 文献综述
    1.1 前言
    1.2 RNAi
        1.2.1 RNA干扰的原理
        1.2.2 RNA干扰的特点
    1.3 RNA干扰介导的方法
        1.3.1 注射法
        1.3.2 饲喂法
        1.3.3 浸液法
        1.3.4 转基因植物
    1.4 RNA干扰的应用
        1.4.1 在基因治疗中的应用
        1.4.2 在基因功能研究中的应用
        1.4.3 在植物改良中的应用
    1.5 在昆虫防治中的应用
    1.6 RNAi应用于昆虫防治的问题和展望
    1.7 小地老虎
    1.8 V-ATP酶
        1.8.1 V-ATP酶的结构和功能
        1.8.2 昆虫V-ATP酶的研究进展
    1.9 研究的目的和意义
第二章 小地老虎V-ATP酶A亚基和B亚基基因全长的克隆
    2.1 前言
    2.2 材料与试剂
        2.2.1 主要试剂
        2.2.2 主要仪器
    2.3 实验方法
        2.3.1 小地老虎总RNA的提取
        2.3.2 特异引物设计
        2.3.3 保守序列扩增
        2.3.4 合成 3′和 5′-RACE-Ready cDNA
        2.3.5 cDNA3′末端和 5′末端的克隆
        2.3.6 连接转化
        2.3.7 测序拼接及CDS区的获得
        2.3.8 基因序列分析及系统进化性分析
    2.4 结果分析
        2.4.1 小地老虎总RNA的提取
        2.4.2 保守序列的扩增
        2.4.3 A亚基 3'和 5'末端的克隆
        2.4.4 B亚基 3'和 5'末端的克隆
        2.4.5 A亚基基因CDS区的克隆及序列分析
        2.4.6 B亚基基因CDS区的克隆及序列分析
    2.5 小结与讨论
第三章 SiRNA的设计与筛选
    3.1 前言
    3.2 材料与试剂
        3.2.1 主要试剂与材料
        3.2.2 主要仪器
    3.3 实验方法：
        3.3.1 SiRNA的设计合成及注射
        3.3.2 显微注射
        3.3.3 定量引物设计
        3.3.4 干扰结果检测
        3.3.5 定量结果分析
    3.4 结果分析
        3.4.1 定量引物标准曲线
        3.4.2 定量结果分析
    3.5 小结与讨论
第四章 杆状病毒表达系统的构建
    4.1 前言
    4.2 材料与试剂
        4.2.1 主要材料
        4.2.2 主要仪器
    4.3 实验方法
        4.3.1 穿梭载体的构建
        4.3.2 细胞培养
        4.3.3 转染并重组病毒表达载体
        4.3.4 噬斑实验
        4.3.5 杆状病毒遗传稳定性
        4.3.6 杆状病毒对小地老虎的干扰效果检测
    4.4 结果分析
        4.4.1 穿梭载体的构建
        4.4.2 重组杆状病毒
        4.4.3 杆状病毒遗传稳定性
        4.4.4 对小地老虎的干扰效果检测
    4.5 小结与讨论
第五章 结论
参考文献
附录
缩略词
致谢
作者简介


【参考文献】：
期刊论文
[1]家蚕空泡型ATP酶（V-ATPase）基因的基本信息及表达特征[J]. 王鑫,李懿,陈全梅,衣启营,谢康,吴用,赵萍.  中国农业科学. 2014(08)
[2]桔小实蝇V-ATPaseG亚基基因的克隆及组织表达特异性分析[J]. 胡黎明,申建梅,宾淑英,林进添.  昆虫学报. 2011(12)
[3]昆虫杆状病毒表达系统的研究及其新进展[J]. 孙阳,张淑颖.  江西农业学报. 2006(05)
[4]小地老虎的防治措施[J]. 张俊斌.  山西农业. 2005(03)
[5]小地老虎在滦南县危害严重[J]. 王洪梅.  河北农业. 2002(03)
[6]蔬菜田小地老虎的发生特点及防治[J]. 姜海洲,李瑛,何永垠,丁志宽.  蔬菜. 2000(06)
[7]小地老虎幼虫龄期外部形态的区别[J]. 陈家暢,李树英.  植物保护. 1964(03)



本文编号：3121481