N-3 PUFA通过DNA甲基化调控FAT-1转基因牛成纤维细胞线粒体能量代谢
发布时间：2021-04-07 00:41
由于哺乳动物体内缺乏有n-3多不饱和脂肪酸脱氢酶,不能自身合成n-3多不饱和脂肪酸（n-3 polyunsaturated fatty acids,n-3PUFA）,人们利用转基因技术将外源的fat-1基因转入动物体内,从而获得内源性n-3 PUFA增多的转基因动物。本试验对fat-1转基因牛（FT组）和野生型牛（WT组）的胎儿成纤维细胞进行转录组和DNA甲基化组学分析,并通过ELISA的方法验证了细胞线粒体能量代谢关键调控因子的变化。与对照组相比,FT牛的细胞全基因组mRNA表达和DNA甲基化程度均发生变化,转录组差异基因富集到与能量代谢和甲基化相关通路,而能量代谢相关通路也在DNA甲基化测序中被富集。对能量代谢相关限速酶及产物进行活性和表达量的检测发现,n-3 PUFA含量增加,在一定程度上抑制脂肪合成,提高脂肪酸合成效率,促进脂肪酸β氧化;降低糖酵解中HK、PFK和PK的活性,抑制糖酵解过程;并且通过降低IDH的活性,减弱TCA能力。分析还发现,高水平的n-3 PUFA降低NADH-辅酶Q还原酶、细胞色素C氧化酶和ATP合酶的活力,显著降低ATP含量,抑制线粒体氧化磷酸化过程。与...
【文章来源】：内蒙古大学内蒙古自治区 211工程院校
【文章页数】：84 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
脂肪酸的分类
内蒙古大学硕士论文14图2.1一般的多不饱和脂肪酸生物合成途径。哺乳动物的酶由黑色实心反应箭头绘制。尽管对于哺乳动物和秀丽隐杆线虫而言，这都是保守的途径，但线虫拥有红色的实心红色箭头Δ12和omega-3去饱和酶。与哺乳动物不同，秀丽隐杆线虫不合成22个碳的PUFA。缩写：AA，花生四烯酸；ACC，乙酰辅酶A羧化酶；ACP，酰基载体蛋白；AdA，二十二碳四烯酸；ALA，α-亚麻酸；cVA，顺式-庚酸；DGLA，二高-γ-亚麻酸；DPA，二十二碳五烯酸；EPA，二十碳五烯酸；ETA，二十碳四烯酸；FAS，脂肪酸合酶；GLA，γ-亚麻酸；LA，亚麻酸；OL，油酸；PAL，棕榈酸；POA，棕榈油酸；SDA，硬脂酸；STE，硬脂酸；THA，四二十碳六烯酸（乳酸），TPA，四二十碳五烯酸[147]。Fig.2.1Thegeneralpolyunsaturatedfattyacidsbiosynthesispathway.Mammalianenzymesaredrawnbysolidblackreactionarrows.AlthoughthisisaconservedpathwayforbothmammalsandC.elegans,thenematodespossessΔ12andomega-3desaturaseenzymesthataresolidredarrows.Unlikemammals,C.elegansdonotsynthesizethe22carbonPUFAs.Abbreviations:AA,arachidonicacid;ACC,acetyl-CoAcarboxylase;ACP,acylcarrierproteins;Ada,docosatetraenoicacid;ALA,α-linolenicacid;cVA,cis-vaccenicacid;DGLA,dihomo-γ-linolenicacid;DPA,docosapentaenoicacid;EPA,eicosapentaenoicacid;ETA,eicosatetraenoicacid;FAS,fattyacidsynthase;GLA,γ-linolenicacid;LA,linolenicacid;OL,oleicacid;PAL,palmiticacid;POA,palmitoleicacid;SDA,stearidonicacid;STE,stearicacid;THA,tetracosahexaenoicacid(nisinicacid),TPA,tetracosapentaenoicacid[147].鉴于n-3PUFA对机体健康及发育有重要作用，利用转基因技术将外源fat-1
N-3PUFA通过DNA甲基化调控FAT-1转基因牛成纤维细胞线粒体能量代谢19图2.1转录组数据分析流程Fig.2.1TheanalysisplanofRNA-Seq2.3.3DNA甲基化测序DNA准备(1)确定细胞生长状态良好；(2)用胰酶消化并收集细胞，转移到2ml旋盖尖底离心管（DNasefree）；(3)25℃离心1000rpm，5min，得到细胞沉淀，去上清（胰酶）；(4)用1mlPBS（DNasefree，室温）清洗一次。25℃离心1000rpm，5min得到细胞沉淀，弃上清；(5)置于-80℃冰箱或液氮中长期保存；(6)运输方式：干冰运输。测序公司（联川生物）使用QIAampFastDNA组织试剂盒（Qiagen,Dusseldorf,Germany）提取总DNA。用分光光度计读取A260/280比值测定DNA含量。当A260/280比值在1.8-2.0时，DNA是可用的。对超声破碎后的DNA样品进行亚硫酸氢盐转化。利用Accel-NGSMethyl-SeqDNALibraryKit（SWIFT，MI，USA）将接头连接到单链DNA片段上。测序及数据分析使用LCSciences的IlluminaHiSeq4000平台上进行了2×150bp的双端测序。数据分析流程如Fig.2.2：
本文编号：3122464
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【学位级别】：硕士
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脂肪酸的分类
内蒙古大学硕士论文14图2.1一般的多不饱和脂肪酸生物合成途径。哺乳动物的酶由黑色实心反应箭头绘制。尽管对于哺乳动物和秀丽隐杆线虫而言，这都是保守的途径，但线虫拥有红色的实心红色箭头Δ12和omega-3去饱和酶。与哺乳动物不同，秀丽隐杆线虫不合成22个碳的PUFA。缩写：AA，花生四烯酸；ACC，乙酰辅酶A羧化酶；ACP，酰基载体蛋白；AdA，二十二碳四烯酸；ALA，α-亚麻酸；cVA，顺式-庚酸；DGLA，二高-γ-亚麻酸；DPA，二十二碳五烯酸；EPA，二十碳五烯酸；ETA，二十碳四烯酸；FAS，脂肪酸合酶；GLA，γ-亚麻酸；LA，亚麻酸；OL，油酸；PAL，棕榈酸；POA，棕榈油酸；SDA，硬脂酸；STE，硬脂酸；THA，四二十碳六烯酸（乳酸），TPA，四二十碳五烯酸[147]。Fig.2.1Thegeneralpolyunsaturatedfattyacidsbiosynthesispathway.Mammalianenzymesaredrawnbysolidblackreactionarrows.AlthoughthisisaconservedpathwayforbothmammalsandC.elegans,thenematodespossessΔ12andomega-3desaturaseenzymesthataresolidredarrows.Unlikemammals,C.elegansdonotsynthesizethe22carbonPUFAs.Abbreviations:AA,arachidonicacid;ACC,acetyl-CoAcarboxylase;ACP,acylcarrierproteins;Ada,docosatetraenoicacid;ALA,α-linolenicacid;cVA,cis-vaccenicacid;DGLA,dihomo-γ-linolenicacid;DPA,docosapentaenoicacid;EPA,eicosapentaenoicacid;ETA,eicosatetraenoicacid;FAS,fattyacidsynthase;GLA,γ-linolenicacid;LA,linolenicacid;OL,oleicacid;PAL,palmiticacid;POA,palmitoleicacid;SDA,stearidonicacid;STE,stearicacid;THA,tetracosahexaenoicacid(nisinicacid),TPA,tetracosapentaenoicacid[147].鉴于n-3PUFA对机体健康及发育有重要作用，利用转基因技术将外源fat-1
N-3PUFA通过DNA甲基化调控FAT-1转基因牛成纤维细胞线粒体能量代谢19图2.1转录组数据分析流程Fig.2.1TheanalysisplanofRNA-Seq2.3.3DNA甲基化测序DNA准备(1)确定细胞生长状态良好；(2)用胰酶消化并收集细胞，转移到2ml旋盖尖底离心管（DNasefree）；(3)25℃离心1000rpm，5min，得到细胞沉淀，去上清（胰酶）；(4)用1mlPBS（DNasefree，室温）清洗一次。25℃离心1000rpm，5min得到细胞沉淀，弃上清；(5)置于-80℃冰箱或液氮中长期保存；(6)运输方式：干冰运输。测序公司（联川生物）使用QIAampFastDNA组织试剂盒（Qiagen,Dusseldorf,Germany）提取总DNA。用分光光度计读取A260/280比值测定DNA含量。当A260/280比值在1.8-2.0时，DNA是可用的。对超声破碎后的DNA样品进行亚硫酸氢盐转化。利用Accel-NGSMethyl-SeqDNALibraryKit（SWIFT，MI，USA）将接头连接到单链DNA片段上。测序及数据分析使用LCSciences的IlluminaHiSeq4000平台上进行了2×150bp的双端测序。数据分析流程如Fig.2.2：
本文编号：3122464
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