过量表达拟南芥EDT1基因对提高玉米耐旱性的研究

发布时间：2017-04-18 08:16

  本文关键词：过量表达拟南芥EDT1基因对提高玉米耐旱性的研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：随着全球经济不断发展,人口总数持续增加,对环境的影响愈来愈烈,种种原因都加快了土地荒漠化,其中干旱缺水现象逐年加剧,严重影响着各类作物的生长发育。全球干旱、半干旱的土地面积在全球土地资源中占据很大的比重,为了满足人们的需求,每年绝大多数玉米不得不被种植于这样贫瘠的土地上,势必会造成玉米产量较低的局面。培育耐旱性玉米已经成为重要的育种焦点和趋势。现代生物育种技术的兴起,无疑对改善、提高玉米产量带来了福音,特别是转基因育种技术在近年来的兴起、应用,达到迅猛发展的阶段,已有大量相关的研究报道。将外源耐旱性基因转入玉米组织,经过一定的筛选培育,从而获得较为理想的耐旱性玉米品种,是解决玉米产量低的有效方式。AtEDTl基因来源于拟南芥,其编码的蛋白由722个氨基酸组成,属于植物特有的一类转录因子家族-同源异型亮氨酸拉链第1V家族。已有研究证实,EDT1转录因子可以调节植物耐旱性相关基因的表达,从而提高作物的耐旱性,最初在烟草中证实了这一功能,后来在水稻中不仅验证了该耐旱性功能,同时还证实该基因的存在可以提高水稻的产量。在其他植物中也有验证,但目前在玉米中还未得到相关功能验证的报道,本实验就是采用农杆菌介导法将构建好的pCB2004-EDT1表达载体转入到玉米的愈伤组织及茎尖组织中,对获得的抗性植株进行PCR和qRT-PCR的检测,确定阳性植株。加代获得高代阳性植株,并测定其产量性状。通过PEG-6000干旱胁迫模拟实验,测定耐旱相关的生理生化指标。经过一系列研究,验证该基因对提高玉米耐旱性的功能,也为培育耐旱性的玉米提供了重要的材料。本研究获得结果如下：(1)遗传转化及抗性植株的获得通过农杆菌介导法,侵染600粒愈伤组织颗粒和1500个茎尖组织,经Basta除草剂筛选,分别获得10株和389株抗性转化植株,移栽大田后分别成活2株愈伤再生植株和291株茎尖再生植株。(2)阳性转基因植株及后代株系的获得通过PCR对转基因T0代目的基因进行特异性扩增并测序,分别获得1株愈伤组织阳性转化植株和20株茎尖组织阳性转化植株。对阳性T0代进行自交获得T1代植株,经PCR检测分别获得4株和20株T1代阳性植株。4株愈伤阳性转基因植株来自于1个T0代阳性植株(T0代编号为04-2)。进一步选取PCR稳定的12株T1阳性茎尖转化植株进行自交加代两次,获得65株T3代阳性植株,其中34株更为确定。经阳性追溯统计,34株茎尖阳性植株分别属于4个转化事件(T0代田间编号分别为43、283、314及284),其中19株来自于编号43(T2代阳性田间编号为1-22),15株来自于编号283(T2代阳性田间编号为5-224-9),编号284和314株系(T2代阳性田间编号分别为9-9和8-13)均获得14株T3代阳性植株。(3)目的基因表达情况提取14株T3代茎尖组织阳性转基因植株叶片的总RNA,利用qRT-PCR相对定量检测目的基因在不同转化事件中的表达情况,整理数据后进行方差分析,结果表明,相比于空白对照18-599W,5个T2代转化株系内基因的表达量均显著性增加,其中,5-22和9-9的表达量约为空白对照的30倍以上。(4)产量性状的测定测定T3代5个茎尖转化植株株系阳性植株的穗长、秃尖长、穗粗、穗行数、行粒数、穗重和百粒重。通过软件JMP 10对各性状进行显著性分析,结果表明1-22株系的百粒重显著高于对照18-599W。但其他各个株系中的其他性状均未表现出显著性的差异。(5)耐旱相关性状鉴定通过PEG-6000模拟干旱胁迫实验测定T3代阳性植株的耐旱相关性状。经方差分析,正常培养和胁迫处理的两种环境下, 18-599W的各项指标前后均没有表现出显著性提高,但编号9-9阳性株系的叶绿素含量、1-22的根系干重、5-22的根冠比是呈显著增加的。干旱胁迫下阳性株系5-22、9-9、1-22的根系相比于非胁迫下阳性株系的根系更为发达。胁迫处理下,相比于对照18-599W,9-9转化株系的叶绿素含量和根系干重显著增加,5-22的根冠比及根系干重显著性增加,1-22的根系干重同样是显著性增加的,但其他根系扫描所测得根系数据并没有表现出显著性差异。
【关键词】：AtEDT1 转基因 玉米 耐旱性
【学位授予单位】：四川农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S513
【目录】：

• 摘要4-6
• Abstract6-12
• 1 研究背景12-24
• 1.1 植物耐旱性的研究概况12-19
• 1.1.1 干旱的状况及其对植物的影响12-13
• 1.1.2 耐旱性转基因玉米的研究概况13-14
• 1.1.3 植物耐旱性机制14-15
• 1.1.4 植物耐旱性鉴定指标15-17
• 1.1.4.1 形态和产量指标15
• 1.1.4.2 生理指标15-16
• 1.1.4.3 生化指标16-17
• 1.1.5 PEG模拟干旱胁迫的研究进展17-19
• 1.1.5.1 PEG简介17-18
• 1.1.5.2 PEG模拟干旱胁迫的研究进展18-19
• 1.2 同源异型域-亮氨酸拉链蛋白(Homedomain-leucine Zipper,HD-ZIP)基因家族的研究现状19-21
• 1.2.1 HD-ZIP蛋白的结构与分类19
• 1.2.2 HD-Zip Ⅳ类转录因子的功能研究19-21
• 1.3 AtEDT1基因的研究进展21-23
• 1.3.1 AtEDT1基因的来源及结构功能研究21-22
• 1.3.2 AtEDT1基因的应用22-23
• 1.4 转基因玉米的转化受体及技术23-24
• 1.4.1 转基因玉米的转化受体系统23-24
• 1.4.2 转基因玉米的转化技术24
• 2 本研究的目的意义24-25
• 3 材料与方法25-41
• 3.1 实验材料25-28
• 3.1.1 植物材料25
• 3.1.2 菌株及载体25
• 3.1.3 主要试剂及试剂盒25-26
• 3.1.4 常用基本溶液26
• 3.1.5 培养基26-27
• 3.1.6 实验仪器27-28
• 3.2 技术路线28
• 3.3 实验方法28-31
• 3.3.1 扩繁表达载体质粒pCB2004-EDT128-29
• 3.3.2 质粒提取29-30
• 3.3.3 农杆菌感受态细胞的制备30-31
• 3.3.4 表达载体质粒转化农杆菌31
• 3.4 玉米的遗传转化31-35
• 3.4.1 农杆菌介导的玉米愈伤组织遗传转化31-33
• 3.4.1.1 玉米愈伤组织的培养31-32
• 3.4.1.2 玉米愈伤组织侵染及共培养32
• 3.4.1.3 清洗侵染的玉米愈伤组织32
• 3.4.1.4 玉米愈伤组织的恢复及筛选培养32
• 3.4.1.5 玉米愈伤组织的分化培养32-33
• 3.4.1.6 再生苗的炼苗、移栽及定植33
• 3.4.2 农杆菌介导的玉米茎尖组织遗传转化33-35
• 3.4.2.1 玉米种子的灭菌33-34
• 3.4.2.2 玉米茎尖组织的侵染34
• 3.4.2.3 再生苗的移栽34
• 3.4.2.4 再生苗的筛选与定植34-35
• 3.5 T_0转基因植株的检测35-36
• 3.5.1 T_0代植株总DNA的提取35
• 3.5.2 T_0代转化植株DNA的PCR检测35-36
• 3.5.3 高代转基因植株的检测36
• 3.6 转化茎尖组织的T_3代阳性转化植株基因的表达量分析36-39
• 3.6.1 模板cDNA制备36-39
• 3.6.1.1 总RNA的提取36-37
• 3.6.1.2 总RNA的反转录37-38
• 3.6.1.3 cDNA的效果检测38-39
• 3.6.2 T_3代植株目的基因AtEDT1的表达量分析39
• 3.7 转化茎尖组织的T_3代转基因植株农艺性状的测定39
• 3.8 T_3代茎尖组织转基因植株的PEG-6000模拟干旱胁迫实验39-41
• 3.8.1 材料39-40
• 3.8.2 实验方法40-41
• 3.8.2.1 实验材料的培养40
• 3.8.2.2 阳性转化植株的确定40-41
• 3.8.2.3 15%PEG-6000模拟干旱胁迫处理41
• 4 结果与分析41-56
• 4.1 扩繁表达载体pCB2004-EDT141-42
• 4.2 表达载体质粒pCB2004-EDT1转化农杆菌菌液42-43
• 4.3 AtEDT1基因的遗传转化43-49
• 4.3.1 农杆菌介导的玉米愈伤组织遗传转化43-45
• 4.3.2 农杆菌介导的玉米茎尖组织遗传转化45-49
• 4.4 T_3代茎尖组织阳性转化植株AtEDT1基因的表达量分析49-51
• 4.4.1 cDNA的制备49-50
• 4.4.2 目的基因AtEDT1的表达量分析50-51
• 4.5 T_3代茎尖组织转基因植株农艺性状的测定51-52
• 4.6 T_3代茎尖组织转基因植株的PEG-6000模拟干旱胁迫实验52-56
• 4.6.1 阳性植株的确定52-53
• 4.6.2 叶绿素含量53-54
• 4.6.3 生物量54-56
• 4.6.4 根系扫描56
• 5 讨论56-60
• 6 进一步研究计划60-61
• 参考文献61-68
• 致谢68-69

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本文编号：314457