高植物蛋白饲料导致的花鲈摄食抑制分子调控机制的初步研究

发布时间：2017-04-18 11:18

  本文关键词：高植物蛋白饲料导致的花鲈摄食抑制分子调控机制的初步研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：花鲈(Lateolabrax japonicus)是我国重要的海水养殖肉食性鱼类品种,对配合饲料中鱼粉依赖性较高,在花鲈饲料中用植物蛋白替代鱼粉会导致花鲈出现明显的摄食抑制现象。本文主要对由高植物蛋白饲料引起的花鲈摄食抑制的分子机制及其摄食调控机理进行初步研究,包括三部分内容,摘要分别如下：1.花鲈Ghrelin/Leptin-NPY/AGRP和：mTOR-NPY摄食调控信号通路相关因子全长cDNA的克隆和序列分析本试验采用简并引物反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)和cDNA末端快速扩增(3'RACE和5'RACE)技术克隆花鲈(Lateolabrax japonicus)摄食调控因子雷帕霉素靶蛋白(mechanistic target of rapamycin, mTOR)、核糖体蛋白S6激酶beta-1 (ribosomal protein S6 kinase beta-1, S6K1)、神经肽Y前体(neuropeptide Y precursor)^脑肠肽前体(preproghrelin)和刺鼠相关蛋白(agouti-related protein, AgRP)基因cDNA全长序列。结果显示：花鲈mTOR基因(GenBank登录号KJ746670)cDNA全长8296 bp,开放阅读7551 bp,编码2516个氨基酸,预测其分子质量为286.14 Ku,与其他物种的相似性为62.0%-98.0%；S6K1基因(GenBank登录号KJ746671)cDNA全长2232 bp,开放阅读框1539 bp,编码512个氨基酸,预测其分子质量为56.87 Ku,与其他物种的相似性为80.4%-84.9%；NPY precursor基因(GenBank登录号KJ850326)cDNA全长676 bp,开放阅读框300 bp,编码99个氨基酸,预测其分子质量为11.26 Ku,与其他物种的相似性为53.6%-99.0%；preproghrelin基因(GenBank登录号KJ850327)cDNA全长1201 bp,开放阅读框324 bp,编码107个氨基酸,预测其分子质量为12.03 Ku,与其他物种的相似性为19.6%～85.0%;AgRP1基因(GenBank登录号KJ825853)cDNA全长739 bp,开放阅读框429 bp,编码142个氨基酸,预测其分子质量为15.86 Ku,与其他物种的相似性为28.9%-88.0%；AgRP2基因(GenBank登录号KJ825854)cDNA全长1357 bp,开放阅读框351 bp,编码116个氨基酸,预测其分子质量为13.46 Ku,与其他物种的相似性为22.4%～93.1%,花鲈摄食调控因子cDNA全长序列的获得将为进一步研究其摄食调控机理奠定基础。2.高植物蛋白导致的花鲈摄食抑制时期Ghrelin/Leptin-NPY/AGRP和mTOR-NPY摄食调控信号通路的响应试验设置等氮等能的对照组(全鱼粉组)和高植物蛋白组(混合植物蛋白完全替代鱼粉)饲料投喂花鲈。在高植物蛋白组出现明显摄食抑制现象时,分别对对照组和高植物蛋白组花鲈摄食后3、6、9、12及24h的下丘脑、肝脏和胃组织Ghrelin/Leptin-NPY/AGRP和mTOR-NPY摄食调控信号通路相关基因进行RT-qPCR分析,试验结果表明：花鲈摄食后各时间点,胃组织中,摄食后3、6、9及12h鱼粉组mTOR的基因表达均显著高于植物蛋白组(P0.05)；胃中鱼粉组摄食后6和24h、肝脏中鱼粉组摄食餐后9和12h S6K1的基因表达均显著低于植物蛋白组(P0.05),而胃中鱼粉组摄食后12h S6K1的基因表达则显著高于植物蛋白组(P0.05)；肝脏中鱼粉组摄食后6和9h leptin基因表达量显著高于植物蛋白组(P0.05);下丘脑中植物蛋白组和鱼粉组NPY precursor的基因表达在餐后各时间点均无显著性差异(P0.05)：胃中鱼粉组摄食后6hpreproghrelin基因表达显著低于植物蛋白组(P0.05)；下丘脑中植物蛋白组和鱼粉组AgRP1的基因表达在餐后各时间点均无显著性差异(P0.05),摄食后6h鱼粉组AgRP2的表达显著高于植物蛋白组(P0.05);mTOR和leptin的表达降低和preproghrelin表达的增加说明了高植物蛋白组花鲈因拒绝摄食而导致机体能量水平降低,而高植物蛋白导致的摄食抑制时期花鲈中枢摄食调控系统对饥饿状态缺乏有效的响应可能是导致其拒食植物蛋白饲料的原因。以上结果为进一步研究肉食性鱼类对高植物蛋白饲料摄食抑制分子机制提供了理论依据。3.高植物蛋白导致花鲈摄食抑制时期下丘脑和胃差异表达转录组分析本试验研究了高植物蛋白饲料对肉食性鱼类花鲈摄食抑制的分子机制,在实验第三周出现明显摄食抑制现象时提取投喂后花鲈的RNA样品,通过RNA-Seq技术,检测对照组(鱼粉为唯一蛋白源)和实验组(全植物蛋白组)摄食后下丘脑和胃组织的基因表达水平变化。转录组结果表明：胃组织中共有5个与摄食调控相关的差异表达基因,下丘脑中共有10个与摄食调控相关的差异基因；其中促胃泌素释放肽、胰高血糖素样肽2受体、雌激素G蛋白偶联受体1、促甲状腺素beta、生长激素基因、催乳激素、生长乳素、阿黑皮素原等基因的下调和胰高血糖素-1、胰高血糖素-2及生长激素受体等基因的上调从代谢水平和生长方面表明高植物蛋白组花鲈因拒绝摄食处于饥饿状态,而YY-A肽、黑色素浓集激素样肽及促肾上腺皮质激素受体1的上调表达可能是导致花鲈拒绝摄食高植物蛋白饲料的原因。本研究首次在转录组水平下揭示了花鲈不同蛋白源相关基因的表达模式,丰富了鱼类对植物蛋白摄食抑制机制的研究内容。
【关键词】：花鲈 高植物蛋白 鱼粉替代 转录组 克隆 摄食调控
【学位授予单位】：中国海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S917.4
【目录】：

• 摘要5-8
• Abstract8-14
• 第一章 绪论14-22
• 1.1 肉食性鱼类植物蛋白替代鱼粉研究状况14-15
• 1.2 花鲈植物蛋白替代研究进展15-16
• 1.3 Ghrelin/Leptin-NPY/AGRP和mTOR-NPY信号通路16-21
• 1.3.1 神经肽Y NPY16-17
• 1.3.2 生长激素促分泌素ghrelin17-18
• 1.3.3 刺鼠相关蛋白AgRP18
• 1.3.4 瘦素leptin18-20
• 1.3.5 雷帕霉素靶蛋白mTOR和核糖体蛋白S6激酶1 S6K120-21
• 1.4 技术路线21-22
• 第二章 花鲈Ghrelin/Leptin-NPY/AGRP和mTOR-NPY摄食调控信号通路相关因子全长cDNA的克隆和序列分析22-49
• 2.1 前言22-23
• 2.2 材料与方法23-27
• 2.2.1 试验材料23
• 2.2.2 试验方法23-27
• 2.3 结果27-30
• 2.3.1 mTOR、S6K1、NPY precursor、preproghrelin及AgRP全长序列27-28
• 2.3.2 mTOR、S6K1、NPY precursor、preproghrelin及AgRP多序列同源性比对分析28-29
• 2.3.3 mTOR、S6K1、NPY precursor、preproghrelin及AgRP系统进化树分析29-30
• 2.4 讨论30-33
• 2.5 结论33-49
• 第三章 高植物蛋白导致花鲈摄食抑制时期Ghrelin/Leptin-NPY/AGRP和mTOR-NPY摄食调控信号通路的响应49-63
• 3.1 前言49-50
• 3.2 材料与方法50-53
• 3.2.1 试验饲料50
• 3.2.2 试验用鱼50
• 3.2.3 样品采集50
• 3.2.4 RNA的提取50
• 3.2.5 反转录50-51
• 3.2.6 荧光定量PCR引物设计51
• 3.2.7 荧光定量PCR51-52
• 3.2.8 数据统计与分析52-53
• 3.3 结果53-59
• 3.4 讨论59-62
• 3.5 结论62-63
• 第四章 高植物蛋白导致花鲈摄食抑制时期下丘脑和胃差异表达转录组分析63-71
• 4.1 前言63
• 4.2 材料与方法63-64
• 4.2.1 试验饲料63
• 4.2.2 试验用鱼63-64
• 4.2.3 样品采集64
• 4.2.4 转录组测序64
• 4.2.5 测序数据整理和分析64
• 4.3 结果64-67
• 4.3.1 鱼粉组和植物蛋白组表达基因的比较64-66
• 4.3.2 与摄食调控相关的差异表达基因66-67
• 4.4 讨论67-70
• 4.5 结论70-71
• 参考文献71-85
• 致谢85-86
• 作者简历86

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本文编号：314776